Фотометрия. Спектроскопия в уф- и видимом диапазонах Природа поглощения в УФ– и ИК– областях спектра

Благодаря простоте аналитических операций и, в большинстве случаев, высокой чувствительности метод нашел широкое применение в фармацевтическом анализе.

УФ-спектрофотометрия используется при установлении подлинности (идентификации), доброкачественности, количественном определении, как индивидуальных веществ, так и компонентов лекарственных форм; испытании по тестам “Растворение” и “Однородность дозирования”.

Метод применяется на таких стадиях изучения лекарственных веществ и лекарственных форм как фармакокинетика, биодоступность, изучение стабильности и установление сроков годности.

Испытание на подлинность лекарственных веществ. В основе этой стадии фармацевтического анализа лежат следующие приемы:

а) нахождение в спектре λ max и λ min , характеризующих области максимального и минимального поглощения;

б) вычисление отношения значений оптических плотностей исследуемого раствора при разных длинах волн;

в) характеристика интенсивности поглощения по величине удельного показателя (Е);

г) сравнение спектра анализируемого вещества со спектром стандартного образца этого же вещества.

Во всех случаях необходимо получение спектра в условиях, приведенных в НД – растворитель, концентрация, интервал длин волн, размер (толщина) кюветы.

Для случая (а) в полученном спектре находят λ max и λ min , сравнивают с такими же характеристиками, приведенными в НД – при идентичности веществ оба значения должны совпадать (табл.7).

Удобным приемом при испытании на подлинность является определение отношения величин поглощения при двух максимумах. Это уменьшает влияние переменных характеристик прибора на испытание и исключает необходимость использования стандартного образца. Такой способ используют в случае анализа натрия пара-аминосалицилата натрия

Таблица 7

Характеристика уф-спектров, используемая при идентификации некоторых лекарственных веществ в фармакопейном анализе

№ п/п	Лекарствен-ное вещество	Концентрация и растворитель	Характеристика, используемая для идентификации
	Амлодипина бесилат	0,005% в 1% растворе 0,1 М HClв метаноле	λ max = 360 ± 2нм; Е= 113-121
	Аминазин	0,0005% в 0,01 М HCl	λ max = 254±2нм, 307±2нм
	Анестезин	0,0005% в 0,1 М NaOH	λ max = 281±2нм; λ min = 238±2нм
	Верапамила гидрохлорид	0,002% в 0,01 М HCl	D 229 = 0,61 – 0,64 D 278 = 0,23 – 0,24
	Дексаметазон	0,001% в 95% спирте	λ max = 240±2нм; D 240нм /D 263нм = 1,9 – 2,1
		0,002% в 95% спирте	λ max =244±2нм, 275±2нм, 281±2нм; λ min =230±2нм, 259±2нм, 279±2нм; приведен рисунок спектра
	Димедрол	0,05% в 95% спирте	λ max =253±2нм, 258±2нм, 264±2нм; λ min =244±2нм, 255±2нм, 263±2нм
	Дротаверина гидрохлорид	0,0015% в 0,1 М HCl	λ max =241±2нм,302±2нм,353±2нм; λ min =223±2нм,262±2нм,322±2нм
	Зопиклон	0,001% в 0,1 М HCl	λ max =303±2нм; D 303 =0,340-0,380
		0,0006% раствор 2,4-динитрофенилгидразона камфоры в 95% спирте этиловом	λ max = 231±2нм, 265±2нм; плечо в области от 273 нм до 277 нм
	Кислота аскорбиновая	0,001% в буферном растворе с рН 7,0	λ max =265±2нм
	Кислота никотиновая	0,002% в 0,1 М NaOH	λ max =258±2нм, 264±2нм, 270±2нм; λ min =240±2нм; в области от 240нм до 256нм наблюдаются два неидентифицированных плеча
	Кислота фолиевая	0,001% в 0,1 М NaOH	Полное совпадение со спектром ГСО в области от 230 до 380 нм
	Нитроксолин	0,0005% раствор в смеси 95% спирт – буферный раствор с рН 9,18 (98:2)	λ max =249±2нм, 341±2нм, два плеча в области от 228нм до 238нм и от 258нм до 268нм
	Офлоксацин	0,001% в 0,1 М HCl	λ max = 226±2нм, 295±2нм; λ min = 265±2нм
	Папаверина гидрохлорид	0,0025% в 0,01 М HCl	λ max = 285±3нм, 309±2нм; λ min = 289±2нм
	Пирацетам	1% водный раствор	Не имеет выраженных максимумов поглощения в области от 230нм до 350нм
	Прогестерон	0,001% в 95% спирте	λ max = 241±2нм; Е= 518-545
	Ранитидина гидрохлорид	0,01% водный раствор	λ max = 229±2нм; 315±2нм; D 229нм /D 315нм = 1,01 – 1,07
	Сульфа-диметоксин	0,000015% в NaOH 0,000015% в HCl	Спектр щелочного раствора препарата, снятый относительно кислого раствора имеет λ max =253±2нм, 268±2нм; λ min = 260±2нм; Спектр кислого раствора препарата, снятый относительно щелочного раствора, имеет λ max =288±2нм
	Тамоксифена цитрат	0,002% в метаноле	λ max =237нм, 275нм
	Фамотидин	0,0025% в фосфатном буфере	Полное совпадение со спектром РСО в области от 230нм до 350нм
	Фуразолидон	0,0015% в ДМФА	λ max =260±2нм, 367±2нм; λ min =302±2нм
	Фурацилин	0,0006% в ДМФА	λ max =260±2нм, 375±2нм; λ min =306±2нм

При испытании на подлинность часто рекомендуется рассчитать Ев максимуме поглощения (например, для левомицетина, адреналина, прогестерона) или сравнить найденное значение оптической плотности в определенном диапазоне длин волн со значениями, приведенными в НД. Так спектр поглощения раствора пиридоксина гидрохлорида в фосфатном буферном растворе (рН = 6,9) с концентрацией 0,5 мг/мл в области от 230 до 250 нм имеет максимумы при 254 и 324 нм, а оптическая плотность при этих максимумах равна соответственно 0,18 и 0,35.

Некоторые испытания на подлинность с использованием УФ-спектрофотометрии требуют применение стандартных образцов (СО) лекарственных веществ. В этом случае проба СО должна быть приготовлена и одновременно определена в тех же условиях, что и испытуемое вещество. Так, УФ-спектр 0,0005% раствора этинитэстрадиола в спирте этиловом должен иметь максимумы и минимумы при тех же длинах волн, что и раствор СО одинаковой концентрации, соответствующие величины поглощения, рассчитанные на сухое вещество при λ max = 281 нм не должны отличаться более, чем на 3%. Такой прием обеспечивает более достоверные результаты, чем при анализе спектра только одного исследуемого соединения.

УФ-спектрофотометрия является также одним из составных комплекса спектральных методов исследования новых биологически активных веществ. Определенные полосы поглощения в спектре могут указать на наличие в структуре этого соединения тех или иных функциональных групп, фрагментов структур (хромофоров). Этим объясняется сходство спектров веществ, содержащих фенильный радикал, например, эфедрина, димедрола, атропина, бензилпенициллина. Они имеют три максимума поглощения: 251, 257 и 263 нм (рис.7).

Лекарственные вещества, содержащие замещенный ароматический радикал – адреналин, морфин, эстрадиол, левомицетин и др. – имеют в спектре один максимум около 260 нм, сопряженную еноновую систему в лекарственных веществах из группы кортикостероидов – около 238 нм (рис.8).

У некоторых лекарственных веществ (производные барбитуровой кислоты, сульфаниламиды, фенолы, некоторые производные пурина и др.) характер спектра может изменяться в зависимости от рН раствора (рис. 9, 10, 11, 12, 14). При этом изменяется λ max (батохромное смещение), усиливается поглощение (увеличивается величина оптической плотности), наблюдается гиперхромный эффект. Кофеин не проявляет кислотных свойств, поэтому максимум поглощения у него в кислой и щелочной среде при одной и той же длине волны – 272 нм (рис. 13). То есть, УФ-спектрофотометрия может дать информацию об определенных свойствах исследуемого вещества.

Одназначного вывода о структуре химического соединения с помощью УФ-спектрофотометрии сделать невозможно, так как интерпретация спектра затруднена из-за присутствия в молекуле более чем одного хромофора. Тем не менее метод позволяет определить некоторые группировки – хромофоры и сделать вывод о характере и степени сопряжения (с удлинением цепи сопряжения наблюдается смещение максимума поглощения в более длинноволновую область, рис.11).

УФ-спектрофотометрия используется для изучения свойств органических соединений: способности к образованию водородной связи, определения рК а кислот и оснований, определения состава и свойств комплексных соединений лекарственных веществ, изомерии.

Цис- и транс- изомеры имеют отличные друг от друга спектры. Транс-форма обычно поглощает сильнее и полоса ее поглощения сдвинута в длинноволновую область; этот факт может служить доказательством изменения структуры в ходе реакции.

Однако, УФ-спектры не дают каких-либо сведений о строении исследуемого вещества, т.к. они позволяют установить лишь наличие хромофоров и гетероатомов.

Кроме того, УФ-спектрофотометрия дает прекрасную возможность для количественного анализа веществ, содержащих такие группировки.

При испытании на доброкачественность (чистоту) используют те же характеристики, что и при идентификации. При наличии примесей может изменяться λ max , появляться дополнительные максимумы, изменяться интенсивность поглощения.

Специфические примеси, присутствующие в лекарственных веществах, как правило, имеют близкое химическое строение с исследуемым веществом. Поэтому особый интерес представляют случаи, когда лекарственное вещество и его специфическая примесь поглощают при разных длинах волн.

Например, λ max адреналина (Ι) располагается при 278 нм, а его специфическая примесь – адренолон (ΙΙ) имеет максимум поглощения при 310 нм.

Согласно требованию фармакопейной статьи, в 0,05% растворе адреналина, приготовленном для испытания на чистоту, оптическая плотность при 310 нм не должна превышать 0,1 (т.е. в адреналине допускается строго нормируемое содержание адренолона).

Количественное определение. Принцип количественного определения методом УФ-спектрофотометрии заключается в следующем: навеску анализируемого образца (субстанция, лекарственная форма и др.) растворяют в подходящем растворителе, если необходимо, дополнительно готовят разведение полученного раствора и измеряют его оптическую плотность при длине волны, указанной в методике. Концентрацию (содержание) анализируемого вещества находят одним из описанных ранее способов (п. 1.2.3.4).

В соответствии с современными требованиями для таблеток, драже, сухих лекарственных средств для инъекций и лекарственных веществ в капсулах с содержанием действующего вещества 0,05 г и менее обязательным является испытание на однородность дозирования, т.е. содержание вещества в каждой отдельной дозе. Для такой оценки, особенно в случае содержания действующего вещества в мг или его долях (таблетки клофелина содержат 0,075 и 0,15 мг действующего вещества) требуется применение высокочувствительного метода. Таким в большинстве случаев и является УФ-спектрофотометрия.

Актуальным является исследование биодоступности лекарственных веществ. Определенной ее характеристикой является тест “Растворение” (ГФ ΧΙ, вып. 2, с.154). УФ-спектрофотометрия, отличающаяся, как правило, высокой чувствительностью является одним из наиболее часто используемых для этой цели методов (табл.8).

Ниже приводятся методики анализа некоторых лекарственных веществ спектрофотометрическим методом в УФ-области, а в табл.8 приведен ряд примеров использования метода УФ-спектрофотометрии в фармакопейном анализе.

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАФЕДРА ФАРМАЦИИ

КУРСОВАЯ РАБОТА ПО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ХИМИИ

Тема: « Препараты эстрогенных гормонов и их синтетические аналоги.

Фармацевтический анализ.

Выполнила:

студентка

фармацевтического

факультета

V курса, 2 группы

Буслаева Н.П.

Проверила:

преподаватель, к.ф.н.

Н.А.

г. Краснодар,

2014

Введение................................................................................................................3

Глава I. Теоретическая часть...............................................................................5

1. Классификация представителей препаратов эстрогенных гормонов

И их синтетических аналогов....................................................................5

1. Физические свойства, используемые для

установления доброкачественности препаратов....................................8

1. Химические методы идентификации......................................................10
2. Способы испытаний на чистоту..............................................................14
3. Химические методы количественного определения.............................15
4. Физические и физико-химические методы количественного

определения...............................................................................................19

1. Условия хранения лекарственных средств, применение и

формы выпуска.........................................................................................20

Глава II. Экспериментальная часть...................................................................21

1. Применение спектрофотометрии в УФ-области спектра

в анализе диэтилстильбэстрола и синестрола в таблетках по 0,001.....21

Заключение..........................................................................................................29

Список литературы.............................................................................................31

Введение

Прорывом медицинского научного сообщества в решении проблемы увеличения средней продолжительности жизни женщины и улучшения качества жизни явилось использование в медицинской практике заместительной терапии препаратами эстрогенных гормонов.

Эстрогенные гомоны в женском организме вырабатываются в фолликулах яичников.

Эстрогенсодержащие препараты начали применять с 40-х годов прошлого века для коррекции эстрогендифицитных состояний, обусловленных возрастным или хирургическим «выключением» функции яичников.

Эстрогены относятся к группе стероидных гормонов и являются производными углеводорода эстрана:

Известны три природных эстрогенных гормона: эстрон, эстрадиол и эстриол:

В течение длительного времени в медицине использовался естественный гормон эстрон в виде масляных растворов. Эстрадиол обладает вдвое большей активностью, но из-за быстрой инактивации он не применялся. Впоследствии было доказано, что эфиры эстрадиола – более устойчивые вещества, чем эстрон. Кроме того они обладают пролонгированным действием.

Из полусинтетических аналогов эстрадиола в качестве лекарственных средств применяют этинилэстрадиол, местранол и эстрадиола дипропионат. Этинилэстрадиол и местранол характеризуются наличием в молекуле этинильного радикала в 17 положении, что привело к повышению в несколько раз эстрогенной активности по сравнению с эстроном и сохранении ее при пероральном применении.

Вещества, обладающие эстрогенной активностью, были обнаружены не только среди стероидных, но и в ряду ароматических соединений, в частности производных фенантрена, дифенильных производных и других. Предполагают, что эстрогенное действие зависит от наличия ароматических ядер в молекуле.

К синтетическим аналогам эстрогенов нестероидной структуры, применяемым в медицинской практике относят синестрол и диэтилстильбэстрол.

Таким образом, эффективность применения эстрогенных лекарственных средств в коррекции гормонального статуса пациентов, доказанная многолетней мировой клинической практикой, обуславливает актуальность изучения свойств и особенностей фармацевтического анализа препаратов данной группы.

Глава I . Теоретическая часть

1. Классификация представителей препаратов эстрогенных гормонов и их синтетических аналогов

Природные эстрогены (фолликулярные гормоны) представляют собой производные углеводорода эстрана.

Важнейшими представителями являются эстрон (рис. 1) и эстрадиол (рис. 2).

Рис. 1. Структурная формула эстрона

(3-гидроксиэстратри-1, 3, 5(10)-ен-17-он)

Рис. 2. Структурная формула эстрадиола

(3, 17β-дигидроксиэстратри-1, 3, 5(10)-ен)

В отличие от андрогенов, в молекулах эстрона и эстрадиола кольцо А является ароматическим, и отсутствует ангулярная метильная группа у 10 атома углерода.

Из полусинтетических аналогов эстрадиола применяют этинилэстрадиол (рис. 3), эстрадиола дипропионат (рис. 4) и местранол (рис. 5).

Рис. 3. Структурная формула этинилэстрадиола

(17α-этинилэстратриен-1,3,5-диол-3,17β)

Рис. 4. Структурная формула эстрадиола дипропионата

(эстратриен-1,3,5(10)-диола-3,17β дипропионат)

Рис. 5. Структурная формула местранола

(17α-этинилэстратриен-1,3,5-диол-3,17β-3-метилового эфира)

В настоящее время синтезирован ряд эстрогенов нестероидной структуры, таких как синэстрол (рис. 6) и диэтилстильбэстрол (рис. 7).

Рис. 6. Структурная формула синэстрола

(мезо-3,4-бис-(п-оксифенил)-гексан)

Рис. 7. Структурная формула диэтилстильбэстрола

(транс-3,4-бис-(п-оксифенил)-гексен-3)

2. Физические свойства, используемые для установления доброкачественности препаратов

По физическим свойствам производные эстрадиола представляют собой белые или со слабым кремоватым оттенком кристаллические вещества. Практически нерастворимы в воде, легко или умеренно (этинилэстрадиол) растворимы в хлороформе, умеренно или легко растворимы (этинилэстрадиол) в этаноле. Эстрадиола дипропионат умеренно и медленно растворим в растительных маслах. Производные эстрадиола имеют в молекуле четыре ассиметрических атома углерода, то есть отличаются друг от друга и от других стероидных гормонов по удельному вращению.

Синтетические эстрогены синэстрол и диэтилстильбэстрол по физическим свойства представляют собой белые кристаллические порошки, без запаха. Практически нерастворимы в воде, легко растворимы в этаноле и эфире, мало растворимы в хлороформе. Синэстрол мало растворим в персиковом и оливковом масле.

К физическим и физико-химическим методам идентификации, основанным на использовании физических свойств данной группы препаратов относят:

1. Определение температуры плавления:

• t пл. (этинилэстрадиол) = 181-186 °С;
• t пл. (местранол) = 149-154 °С;
• t пл. (эстрадиола дипропионат) = 104-108 °С;
• t пл. (синэстрол) = 184-187 °С;
• t пл. (диэтилстильбэстрол) = 168-174 °С.

1. Определение удельного угла вращения:

• 0,4 % раствор в пиридине для этинилэстрадиола = -27 до -31°;
• 2% раствор в хлороформе для местранола = + 2 до + 8°;
• 1 % раствор в диоксане для эстрадиола дипропионата = + 37 до 41°.

1. УФ и ИК спектроскопия:

• УФ спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в смеси этанола и натрия гидроксида в области 220-330 нм имеет максимумы поглощения при 241 и 299 нм и минимумы поглощения при 226 и 271 нм, а раствор в этаноле – максимум поглощения при длине волны 280 нм.
• Эстрадиола дипропионат - 0,01 % раствор в этаноле, который в области 220-235 нм должен иметь два максимума поглощения при 269 и 276 нм.
• Подлинность этинилэстрадиола, местранола и эстрадиола дипропионата подтверждают по ИК-спектрам, снятых в вазелиновом масле в области 4000 – 200 см -1 .
• В растворе этанола в области 230-250 нм у 0,005 % раствора синэстрола имеют максимумы поглощения при 280 нм, минимум – при 247 нм и плечо при от 283 нм до 287 нм,
• 0,01 % раствор диэтилстибэстрола – максимум поглощения при 242 нм и плечо при от 276 до 280 нм.

3. Химические методы идентификации

Общегрупповые реакции на стероидное ядро:

1. При действии концентрированной серной кислоты, раствор в присутствии этинилэстрадиола приобретает оранжево-красную окраску с желтовато-зелёной флуоресценцией, после добавления полученного раствора к 10 мл воды окраска изменяется до фиолетовой и выпадает фиолетовый осадок.
2. Местранол с концентрированной серной кислотой образует кроваво-красное окрашивание с желтовато-зелёной флуоресценцией.

Частные реакции идентификации:

1. Кислотный гидролиз под действием концентрированной серной кислоты эстрадиола дипропионата с образованием эстрадиола и пропионовой кислоты:

Эстрадиола дипропионат эстрадиол

Последующее нагревание в присутствии этанола ведет к образованию этилового эфира пропионовой кислоты, имеющего характерный запах:

C 2 H 5 -COOH + C 2 H 5 OH = C 2 H 5 -COO-C 2 H 5 + H 2 O

1. Наличие фенольного гидроксила в молекуле этинилэстрадиола подтверждают реакцией образования бензоата этинилэстрадиола, имеющего t пл. = 199-202 °С.

Также по реакции образования азокрасителя с диазотированной сульфаниловой кислотой:

Образуется раствор темно-красного цвета.

1. Наличие незамещенных фенольных гидроксилов в молекулах синэстрола и диэтилстильбэстрола можно обнаружить с помощью хлорида железа (III ). Спиртовые растворы диэтилстильбэстрола окрашиваются в зеленый цвет, постепенно переходящий в желтый.
2. Реакция образование бром-производных синэстрола: под действием бромной воды на его раствор в ледяной кислоте уксусной выделяется осадок тетрабромсинэстрола желтого цвета:

Диэтилстильбэстрол при выполнении той же реакции в присутствии жидкого фенола приобретает появляющееся при нагревании изумрудно-зеленое окрашивание.

1. Реакция нитрования синэстрола: при добавлении кислоты азотной и нагревании на водяной бане постепенно появляется жёлтое окрашивание:

1. При действии концентрированной серной кислотой на хлороформный раствор синэстрола в присутствии формалина, слой хлороформа окрашивается в вишнево-красный цвет. Раствор диэтилстильбэстрола в концентрированной серной кислоте имеет ярко-оранжевое окрашивание, постепенно исчезающее после разбавления водой
2. Нагревание диэтилстильбэстрола с уксусной кислотой и ванилином с последующим добавлением хлороводородной кислоты, кипячением и прибавлением хлорамина (после охлаждения) приводит к возникновению синего окрашивания
3. Раствор диэтилстильбэстрола в ледяной уксусной кислоте после добавления фосфорной кислоты и нагревании на водяной бане приобретает интенсивное желтое окрашивание, которое почти исчезает при разбавлении ледяной уксусной кислотой.,

4. Способы испытаний на чистоту

Примеси посторонних стероидов в препаратах эстрогенных гормонов определяют методом ТСХ на пластинках Силуфол УФ- 254. В качестве свидетелей используют СОВС эстрона, эстрадиола и др. Допускается сумарное содержание примесей стероидов – не более 2 %, в т.ч. в этинилэстрадиоле не более 1 % эстрона.

Наличие посторонних примесей в синтетических аналогах эстрогенов нестероидной структуры устанавливают методом ТСХ на пластинках со слоем силикагеля или на Силуфоле УФ-254 восходящим методом, используя систему растворителей бензол-гексан-ацетон (синэстрол) или хлороформ-метанол (диэтилстильбэстрол). Проявителем служит фосфорномолибденовая кислота.

В диэтилстильбэстроле по величине оптической плотности (не более 0,5) 1% - ного раствора в этаноле при 325 нм определяют наличие примеси 4,4 – дигидроксистилбена и родственных эфиров.

5. Химические методы количественного определения

1. Для количественного определения эстрадиола дипропионата используют реакцию щелочного гидролиза точно отмеренным количеством 0,1 М спиртового раствора калия гидроксида, избыток которого титруют кислотой хлористоводородной 0,1 М. Индикатор фенолфталеин.

KOH + HCl = KCl + H 2 O

1. Количественное определение синэстрола в субстанции выполняют методом косвенной нейтрализации. К субстанции синэстрола прибавляют уксусный ангидрид в пиридине, при нагревании получают диацетилированное производное синэстрола (сложный эфир). Избыток уксусного ангидрида, превратившегося в уксусную кислоту оттитровывают 0,5 М раствором натрия гидроксида. Индикатор фенолфталеин. Параллельно выполняют контрольный опыт с тем же количеством уксусного ангидрида.

Аналогичный процесс происходит при определении диэтилстильбэстрола.

1. Количественно определить синэстрол можно также обратным бромид-броматометрическим методом. Бром, выделившийся за счет взаимодействия 0,1 М раствора бромата калия и бромида калия, осаждает синэстрол в виде тетрабромпроизводного. Избыток титранта определяют йодометрическим методом:

1. Этинилэстрадиол количественно определяют методом косвенной нейтрализации. В качестве растворителя используют очищенный тетрагидрофуран. Выделившуюся после добавления серебра нитрата азотную кислоту титруют 0,1 М растворов натрия гидроксида. Точку эквивалентности определяют потенциометрически со стеклянным электродом. Этинилэстрадиол образует с нитратом серебра двойную соль, которая состоит из серебряной соли этинилэстрадиола и шести молекул нитрата серебра. [ 3]

Пример количественного определения синэстрола титриметрическим методом:

Дайте заключение о качестве синэстрола (М.м. = 270,37 г/моль) по количественному содержанию с учётом требований ГФ X (должно быть синэстрола в субстанции не менее 98,5 %), если на навеску 0,4988 г для ацетилирования взято 5 мл раствора уксусного ангидрида в безводном пиридине, а на титрование избытка уксусного ангидрида и выделившийся кислоты уксусной израсходовано 17,60 мл 0,5 моль/л раствора натрия гидроксида с К = 1,0013. На контрольный опыт пошло 24,88 мл раствора титранта.

Метод косвенного неводного алкалиметрического определения синэстрола.

Химизм реакций:

После реакции ацетилирования непрореагировавший уксусный ангидрид подвергается гидролизу с образованием уксусной кислоты:

2CH 3 COOH + 2NaOH = 2CH 3 COONa + 2H 2 O

К стех . = 2:2 = 1:1 = 1. Раствор титранта приготовлен из реальных частиц.

Но взаимодействует 1 моль синэстрола с 2 моль уксусного ангидрида.

Следовательно, F экв. = 1:2 = ½.

М.э. (синэстрола) = ½ × М.м. (синэстрола) = ½ × 270,37 г/моль = 135,185 г/моль экв.

Т = М.э. × C / 1000 = 135,185 г/моль экв × 0,5 моль/л / 1000 = 0,06759 г/мл.

C = (V контр. × K 1 - V × K 2 ) × T × 100 % / a = (24,88 мл × 1 – 17,60 мл × 1,0013) × 0,06759 г/мл × 100 % / 0,4988 г = 98,38 %.

Вывод: субстанция синэстрола по количественному содержанию синэстрола не соответствует требованию НД, так как содержание ниже нормативного – должно быть не менее 98,5 %.

6. Физические и физико-химические методы количественного анализа

1. Фотоколориметрическое определение этинилэстрадиола основано на применении диазореактива (смесь сульфаниловой кислоты, натрия нитрита и кислоты хлористоводородной). В щелочной среде образуется биазопроизводное этинилэстрадиола, окрашенное в красный цвет. В качестве раствора сравнения используют раствор этого же производного с известной концентрацией и известной оптической плотностью.

1. Синэстрол и диэтилстильбэстрол количественно также можно определить фотоэлектроколориметрически по окрашенному в красный цвет продукту биазосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой.

7. Условия хранения лекарственных средств, применение и формы выпуска

Производные эстрадиола хранят по списку Б. Этинилэстрадиол хранят в хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, а местранол и эстрадиола дипропионат – в сухом, защищенном от света месте.

Применяют в качестве эстрогенных средств. Учитывая прлонгированное действие эстрадиола дипропионата, его вводят внутримышечно по 1 мл 0,1 % раствора в масле 2-3 раза в неделю. Этинилэстрадиол назначают внутрь в виде таблеток по 0,00001 и 0,00005 г.

Местранол является одним из компонентов таблеток «Инфекундин» - активного перорального контрацептива, содержащего 0,0001 г. местранола и 0,0025 г. норэтинодрела.

Этинилэстрадиол входит в состав таких противозачаточных средств как «Марвелон», «Нон-овлон», «Овидон», применяемых в виде таблеток.

Синтетические эстрогенные препараты хранят по списку Б, в хорошо укупоренной таре, предохраняющей от воздействия света.

По фармакологическому действию они близки к природным эстрогенным гормонам. При пероральном применении не разрушаются в желудочно-кишечном тракте, быстро всасываются. Назначают внутрь в виде таблеток по 1 мг и внутримышечно в виде маслянных растворов 0,1%-ной и 2-3%-ной концентрации. Растворы высокой концентрации (2-3%) назначают при лечении злокачественных новообразований.

Глава II . Экспериментальная часть

1. Применение спектрофотометрии в УФ-области спектра

в анализе диэтилстильбэстрола и синестрола в таблетках по 0,001

Абсорбционная УФ-спектрофотометрия основывается на измерении количества поглощенного вещества электромагнитного излучения в определенной узковолновой области.

Обычно для УФ-измерений используют приближенно монохроматическое излучение в области от 190 до 380 нм.

Основные понятия

Поглощение (I t ) - десятичный логарифм обратной величины пропускаемости (J ). В ГФ используются термины «оптическая плотность» (D ), а также «экстинкция» (Е).

Пропускаемость (J ) - частное от деления интенсивности света, прошедшего через вещество, на интенсивность света, падающего на вещество.

Поглощаемость (а t ) - частое от деления поглощения (D ) на концентрацию вещества (С), выраженную в граммах на литр, и длину слоя поглощения в сантиметрах (L ):

В фармакопеях чаще применяется термин «удельный показатель поглощения» , когда концентрацию (С) выражают в граммах на 100 мл; таким образом = 10 × а t .

Молярный показатель погашения (ε) - частное от деления поглощения (I t ) на концентрацию вещества (С), выраженную в молях на литр, и длину слоя поглощения в сантиметрах.

Спектр поглощения - графическое выражение отношения поглощения (или любой функции) к длине волны (или любой функции длины волны).

Приборы. Фармакопея не указывает конкретные типы приборов, рекомендованные для выполнения измерений. В нашей стране применяются как отечественные, так и импортные приборы. Для обеспечения единства измерений рекомендуется при эксплуатации прибора точно придерживаться установленных рабочих условий. Особенно важно обеспечить метрологическое обслуживание приборов в отношении их калибровки как по шкале длин волн, так и по фотометрической шкале. Это обслуживание, как правило, проводят соответствующие государственные метрологические организации.

Факторы, влияющие на воспроизводимость и правильность результатов.

Для получения достоверных данных необходимо строго следовать инструкции по уходу за прибором и его эксплуатации, обращать внимание на такие факторы, как точность толщины кювет и их спектральная пропускаемость.

Кюветы, применяемые для испытуемого и контрольного растворов, должны быть одинаковыми и иметь одну и ту же спектральную пропускаемость, если они содержат только один растворитель. В ином случае необходимо внести соответствующую поправку.

Особое внимание следует обращать на чистоту кювет. Нельзя касаться пальцами наружных поверхностей кюветы, на них не должна попадать жидкость (растворитель или испытуемый раствор). Следует также учитывать возможные ограничения, связанные с использованием растворителей.

Чувствительность метода определяется в основном способностью вещества к поглощению и выражается, как было указано выше, молярным коэффициентом поглощения. Предельные концентрации веществ, анализируемые при помощи спектрофотометрии, как правило, меньше, чем в титриметрических или гравиметрических методах. Этим объясняется использование спектрофотометрии при определении небольших количеств веществ, особенно в различных лекарственных формах.

Основным условием для количественного анализа является соблюдение закона Бугера - Ламберта - Бера в пределах соответствующих концентраций. Для проверки соответствия закону строят график зависимости (поглощение - длина волны) или рассчитывают фактор для каждого стандартного раствора и определяют область концентраций, в пределах которой величина А/С остается постоянной.

Существуют и применяются два принципиально различных способа спектрофотометрических количественных определений. По одному из них содержание вещества в процентах (С иссл. ) рассчитывают на основании предварительно вычисленной величины поглощения, чаще по величине Е 1% 1см .

Где

V – разведение, мл. Остальные обозначения смотри выше.

Основным недостатком приведенного определения является общеизвестный факт: различные спектрофотометры (даже различные приборы одной и той же модели и одного производства) дают значительные отклонения по величине поглощения для одного и того же стандартного раствора.

Более достоверные и воспроизводимые результаты обеспечивают сравнение поглощения испытуемого вещества с поглощением стандартного образца, определенного в тех же условиях. При этом учитываются многочисленные факторы, влияющие на спектрофотометрические измерения, например установка длины волны, ширина щели, поглощение кюветы и растворителя и др.

Спектрофотометрическое количественное определение содержания лекарственного вещества при анализе индивидуальных веществ должно быть связано с применением специально приготовленного стандартного образца этого вещества.

Стандартные образцы - это вещества, с которыми проводят сравнение испытуемых лекарственных средств при их анализе с использованием физико-химических методов. Эти образцы подразделяются на Государственные стандартные образцы (ГСО) и рабочие стандартные образцы (РСО). ГСО представляет собой особо чистый образец субстанции лекарственного вещества.

Выпуск ГСО осуществляют в соответствии с фармакопейной статьей. Фармакопейная статья на ГСО разрабатывается и пересматривается пред приятиями (организациями), выпускающими или разрабатывающими лекарственные средства, согласовывается с Государственным научно- исследовательским институтом по стандартизации лекарственных средств и утверждается в установленном порядке. В качестве РСО используют образцы серийных лекарственных веществ, соответствующих требованиям фармакопейной статьи. При расчете количественного содержания определяемого вещества в лекарственной форме учитывают фактическое содержание данного вещества в РСО.

Определение содержания вещества при

использовании стандартного образца

Расчет количественного содержания индивидуального вещества в процентах (X ) при использовании стандартного образца проводится по формуле:

Если концентрация стандартного раствора РСО выражена в процентах (С станд. = %), то формула расчёта содержания в г имеет вид:

Если мы знаем оптическую плотность стандартного раствора лекарственного вещества, и рассчитаем удельный показатель поглошения раствора лекарственного вещества, то также сможем рассчитать содержание лекарственного вещества в таблетке (в граммах), считая на среднюю массу таблетки:

Концентрация раствора с использованием стандартного образца лекарственного вещества (в %) выражается по формуле:

Где

V 1 – объём первого разведения, мл;

V 2 – объём второго разведения, мл.

Остальные обозначения смотри выше.

Для субстанции, г:

Для твёрдых дозированных лекарственных форм (таблетки, драже), г:

Где

100 – коэффициент пересчёта.

Пример № 1

Удовлетворяют ли таблетки синэстрола по количественному содержанию требованиям ФС, если для раствора, полученного растворением 0,3005 г порошка растёртых таблеток в спирте этиловом в мерной колбе вместимостью 100 мл, оптическая плотность составляет 0,550, для раствора ГСО синэстрола с содержанием 0,00003 г/мл, оптическая плотность составляет 0,560 (ɣ=280 нм, в слое 1 см). Содержание синэстрола должно быть 0,0009 – 0,0011 г считая на среднюю массу таблетки (Р = 0,101 г).

× а = 0,550 × 0,00003 г/мл × 100 мл × 0,101 г / 0,560 × 0,3005 г = 0,00099 г ≈ 0,001 г.

Пример № 2

Оцените качество таблеток синэстрола по 0,001 г, если при спектрофотометрическом определении (ɣ=280 нм) получены следующие результаты: оптическая плотность стандартного раствора = 0,385, концентрация стандартного раствора 0,00003 г/мл, оптическая плотность исследуемого раствора = 0,392. Массу порошка растёртых таблеток 0,3204 г растворили в 100 мл спирта этилового абсолютированного. Рассчитайте содержание в г, считая на среднюю массу таблетки (масса 20 таблеток составляет 2,040 г). По ФС содержаться должно 0,0009 – 0,0011 г в пересчёте на одну таблетку.

Вначале рассчитывают среднюю массу одной таблетки:

2,040 г / 20 = 0,102 г.

С иссл. = D иссл. × С станд. × V × P / D станд. × а = 0,392 × 0,00003 г/мл × 100 мл × 0,102 г / 0,385 × 0,3204 г = 0,00097 г ≈ 0,001 г.

Вывод: по количественному содержанию синэстрола в таблетках по 0,001 г удовлетворяют требованиям ФС.

Заключение

Современная наука и общество диктуют принципиально новые требования ко всей системе здравоохранения, в частности к сектору создания фармацевтических препаратов.

С одной стороны, растет ценность здоровья в системе приоритетов общества, возникают новые медико-технологические и социальные вызовы, связанные с изменениями в демографической структуре населения. С другой – благодаря развитию медицинских технологий существенно повышаются возможности реально влиять на показатели здоровья населения, о чем свидетельствуют значительные успехи в борьбе с наиболее опасными для жизни заболеваниями, достигнутые в западных странах за последние 2-3 десятилетия.

Следует также учитывать, что глобальной мировой тенденцией является продолжающийся рост потребления лекарственных средств, что связано, с одной стороны, с повышением уровня жизни населения, а с другой – с его старением.

Перспективным направлением в отношении эстрогенных препаратов является усовершенствование существующих и разработка новых способов получения полусинтетических и синтетических аналогов эстрогенных гормонов.

Большим преимуществом синтетических эстрогенов является доступность их синтеза ввиду несложности химической структуры. Образование простых и сложных эфиров не снижает активности эстрогенов, но увеличивает продолжительность действия.

Предполагают, что эстрогенное действие зависит от наличия ароматических ядер в молекуле. Важная роль принадлежит гидроксильным и кетонным группам, способным образовывать водородные связи и взаимодействовать в организме с белками.

Препараты эстрогенных гормонов используют для лечения большого числа серьезных патологий, в том числе и злокачественных новообразований.

Приобретшая широкую популярность в последнее десятилетие гормональная контрацепция также основана на широком использовании препаратов эстрогенных гормонов в своем составе.

Изучение особенностей фармацевтического анализа этой группы препаратов подтверждает преимущества использования физико-химических методов, а именно УФ - спектрофотометрии, позволяющей проводить идентификацию веществ, устанавливать наличие посторонних примесей и количественное определение стероидных эстрогенов и их синтетических аналогов нестероидной структуры.

Список литературы:

1. Арзамасцев А.П. Анализ лекарственных смесей / А.П. Арзамасцев, В.М. Печенников, Г.М. Родионова, В.Л. Дорофеева, Э.Н. Аксёнова. – М.: Компания «Спутник +», 2000. – 275 с.
2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч.1. Общая фармацевтическая химия: Учебник для фармацевтических институтов и факультетов мед. вузов / В.Г. Беликов. - М.: Высшая школа, 1993. – 432 с;
3. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч.2. Специальная фармацевтическая химия: Учебник для вузов / В.Г. Беликов. - Пятигорск, 1996. – 608 с.
4. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. Учебное пособие / В.Г. Беликов. 2-е изд. – М.: «МЕДпресс-информ», 2008. – 614 с.
5. Блинникова А.А. Спектрофотометрия и фотоэлектроколориметрия в анализе лекарственных средств: Учебное пособие / А.А. Блинникова. – Томск: Изд-во СибГМУ, 2005. – 96 с.
6. Витенберг И.Г. Контроль качества лекарственных средств, изготовляемых в аптеках: методические рекомендации к лабораторному практикуму. 4-е изд. / И.Г. Витенберг, Н.И. Котова, В.Ю. Подушкин, М.П. Блинова. – Спб.: Изд-во СПХФА, 2012. – 76 с.
7. XII изд.: Вып. 1. / М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. – 704 с.
8. Государственная фармакопея РФ – XII изд.: Вып. 2. / М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2010. – 600 с.
9. X изд. / МЗ СССР. – 10-е изд. – М.: Медицина, 1968. – 1079 с.
10. Государственная фармакопея СССР – XI изд.: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. – 11-е изд., доп. – М.: Медицина, 1987. – 336 с.
11. Дудко В.В. Анализ лекарственных веществ по функциональным группам: Учебное пособие / В.В. Дудко, Л.А. Тихонова; под ред. С.И. Краснова, М.С. Юсубова. – Томск: Изд-во НТЛ, 2004. – 140 с.
12. Ермилова Е.В. Анализ лекарственных средств: Учебное пособие / Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова, В.В. Дудко. – Томск: Изд-во СибГМУ, 2010. – 201 с.
13. Контроль качества лекарственных средств промышленного производства: учебное пособие / И.Г. Витенберг, Е.И.Саканян, Т.Ю.Ильина, В.Ю. Подушкин. и др. – Спб.: Изд-во СПХФА, 2006. – 104 с;
14. Мельникова Н.Б. Фармакопейный анализ органических лекарственных веществ: Учебно-методическое пособие для студентов 3 курса фармацевтического факультета / Н.Б. Мельникова. – Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2009. – 65 с.
15. Нестерова Т.А. Методы количественного определения лекарственных веществ в субстанциях и лекарственных формах индивидуального изготовления (для интернов и слушателей ФПК): Учебно-методическое пособие по специальности 060108 (040500) – фармация / Т.А. Нестерова, В.А. Карпенко. – Воронеж: Издательство ВГМУ, 2006. – 84 с.
16. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии: Учебное пособие / Аксёнова Э.Н., Андрианова О.П., Арзамасцев А.П. и др.; под ред. А.П. Арзамасцева. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2004. – 384 с.
17. Струсовская О.Г. Контроль качества лекарственных форм индивидуального изготовления: Методические указания для студентов VI курса заочной формы обучения фармацевтического факультета по выполнению курсовой работы / О.Г. Струсовская. – Архангельск: Изд-во СГМУ, 2007. – 26 с.
18. Струсовская О.Г. Общие методы установления качества лекарственных веществ. Издание 2. Пересмотренное и дополненное в соответствии с требованиями ГФ XII Российской Федерации: Методические указания к лабораторным занятиям по фармацевтической химии для студентов III курса фармацевтического факультета / О.Г. Струсовская. – Архангельск: Изд-во СГМУ, 2009. – 29 с.
19. Струсовская О.Г. Особенности анализа готовых лекарственных форм: Методические указания к лабораторным занятиям для студентов IV курса фармацевтического факультета. Ч.1. / О.Г. Струсовская. – Архангельск: Изд-во СГМУ, 2006. – 55 с.
20. Струсовская О.Г. Особенности анализа готовых лекарственных форм:

Методические указания к лабораторным занятиям для студентов IV курса

Фармацевтического факультета. Ч.2 / О.Г. Струсовская. – Архангельск:

Изд-во СГМУ, 2006. – 39 с.

1. Фармацевтическая химия: Учебное пособие / Под ред. А.П. Арзамасцева. – 3-е изд. исп. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – 640 с.
2. Ярыгина Т.И. Фармацевтический анализ по функциональным группам и общие титриметрические методы анализа: Учебно-методическое пособие для студентов очного факультета / Т.И. Ярыгина, Г.Г. Перевозчикова, О.Е. Саттарова, О.Л. Визгунова и др.; под общ. ред. Ярыгиной Т.И., Коркодиновой Л.М. – Пермь: Изд-во ПГФА, 2004. – 72 с.

PAGE \* MERGEFORMAT 1

Приборы для фиксации оптических спектров построены по единому принципу. В качестве источника УФ излучения обычно применяется "водородная лампа" (электрический разряд в атмосфере водорода при низком давлении), которая дает практически непрерывный спектр излучения в области 190-360 нм.

Для работы в видимой области служит лампа накаливания с вольфрамовой спиралью. Излучение от источника попадает в монохроматор, состоящий из зеркала, кварцевой призмы и щели. Отражаясь от зеркала, свет разлагается призмой или дифракционные решетки и затем с помощью щели из спектра выделяется узкая область. При вращении призмы спектр перемещается по отношению к щели, что позволяет получать лучи света со строго определенной длиной волны, обычно с точностью ±0,5 нм. Монохроматическое излучение пропускается через кварцевую кювету, содержащую раствор исследуемого вещества в прозрачном для УФ- области растворителе. Толщина кювет 1-10 см, наиболее распространенные кюветы имеют сечение 1´1 см, и для их заполнения требуется около 3 мл раствора. Интенсивность прошедшего через кювету света измеряется с помощью фотоэлемента, величина тока которого пропорциональна интенсивности падающего света. Ток усиливается и регистрируется потенциометром.

Сравнивается интенсивность светового луча, прошедшего через исследуемый раствор, и луча, пропущенного через аналогичную кювету с чистым растворителем. Получаемая разность соответствует поглощению растворенного исследуемого вещества.

Такое сравнение может быть проведено двумя путями. При наличии одного светового луча на его пути попеременно ставят кювету с исследуемым раствором и с растворителем (кювету сравнения). Спектр строят по точкам, постепенно вручную настраивая прибор на определенные длины волн. В современных регистрирующих приборах световой поток делится на два одинаковых пучка, один из которых проходит через исследуемый раствор, а другой - через растворитель, причем как сравнение интенсивностей прошедших через кюветы световых потоков, так и непрерывное изменение длин волн производится автоматически. В том и другом случае получают спектр вещества, представляющий собой зависимость оптической плотности раствора (D) от длины волны поглощаемого света:

В точках максимумов молярный коэффициент погашения вычисляют по формуле

Спектр в большинстве случаев представляет собой кривую с одним пологим максимумом. Большая ширина полосы поглощения обусловлена тем, что помимо основных уровней электронных переходов существуют подуровни, связанные с колебаниями молекулы. Многочисленность таких подуровней обычно приводит к тому, что соответствующие им отдельные максимумы сливаются в один, имеющий пологую форму. В отдельных случаях, например для ароматических соединений, за счет колебательных подуровней максимум поглощения представляет собой набор узких полос по обе стороны от основной. В таких случаях принято говорить, что максимум имеет тонкую структуру.

Приборы различных схем позволяют получать спектры в различных областях спектра. В УФ области поглощают все органические вещества. Длины волн менее 190 нм (дальняя, или вакуумная область УФ спектра) малопригодны для работы, так как в этой области поглощают компоненты воздуха - кислород и азот. Приборы для исследований в интервале длин волн 120-190 нм с вакуумными камерами существуют, однако они сложны и редко используются в обычной лабораторной практике; существуют схемы, где влияние газов воздуха ликвидируют продувкой полостей, по которым проходит луч непоглощающим газом.

Для волн длиной более 200 нм воздух прозрачен, что делает ближнюю ультрафиолетовую и видимую области спектра (190-800 нм) удобными для измерений. В том же интервале прозрачен кварц, который в УФ спектроскопии применяется как оптический материал для изготовления призм и кювет. Приборы для получения спектров поглощения в этой области просты и доступны. Необходимые для исследования количества вещества невелики - около 0,1 мг. В связи с этим УФ спектроскопия в настоящее время является одним из наиболее распространенных физико-химических методов исследования органических соединений.

Поглощение органическими веществами электромагнитных колебаний в ультрафиолетовой (УФ) и видимой области обусловлено переходом электронов со связывающих орбиталей на разрыхляющие или несвязывающие орбитали; такое состояние молекулы называется возбужденным.

При взаимодействии с квантом света электрон, поглощая энергию, может переходить с высшей заполненной орбитали на низшую вакантную орбиталь. Электроны достаточно прочно удерживаются ядром, поэтому для их возбуждения требуются большие энергии и, следовательно, электромагнитное излучение, имеющее малые длины волн (120 - 800 нм).

Электроны в атомах и молекулах занимают орбитали со строго определенной энергией. Уровень энергии атомных орбиталей определяется соответствующим набором квантовых чисел. Молекулярные орбитали могут рассматриваться как линейные комбинации атомных. Такая комбинация дает связывающую орбиталь (­¯ , электроны с антипараллельными спинами, нормальное состояние) и разрыхляющую орбиталь (­­ , электроны с параллельными спинами, возбужденное состояние).

В обычных органических молекулах присутствуют электроны s - и p -связей, а также электроны неподеленных пар гетероатомов, или n -электроны. Их относительные энергетические уровни и сравнительные энергии возможных переходов в возбужденное состояние представлены на рис. 4, из которого следует, что наибольшая энергия кванта необходима для осуществления перехода s®s* , т.е. для возбуждения электронов наиболее прочной s -связи необходимы кванты света минимальной длины волны. Энергия переходов n®s* и p®p* меньше, и, следовательно, длина волны света, возбуждающего такой переход, соответственно больше. Энергия n -уровня электронов выше энергии p -уровней, поэтому возбуждение вызывается квантами света еще большей длины волны. Практическое значение имеют переходы n ®p* и p®p* , поскольку только им соответствуют длины волн, попадающие в рабочий диапазон прибора. Исключение составляют переходы p®p* изолированных двойных связей С=С и C=N , а также тройных связей и (l макс 160-180 нм). Для изолированных кратных связей в используемом для измерений интервале проявляется только переход карбонильной группы С=О (l макс » 270 нм).

Группировки, вызывающие избирательное поглощение электромагнитного колебания в УФ- области, называются хромофорами . Основными хромофорами, дающими максимум поглощения в области 200-800 нм, являются системы сопряженных двойных связей. Орбитали, образуемые двумя сопряженными двойными связями, представлены на рис. 5.

Из рисунка очевидно, что при взаимодействии двух p - орбиталей, соответствующих изолированным двойным связям, образуются две новые орбитали: связующая (p+p ) и разрыхляющая (p-p ). Возбужденному состоянию также соответствуют две орбитали. Следовательно, для возбуждения электронов сопряженной системы, т.е. для осуществления перехода с высшей заполненной (p-p ) на низшую вакантную (p*+p* ) орбиталь, требуется меньшая энергия, чем для возбуждения электронов изолированных двойных связей (p®p* ), так что сопряженные двойные связи будут поглощать кванты света с большей длиной волны, чем изолированные двойные связи. С ростом числа сопряженных двойных связей энергия, необходимая для возбуждения электронов, будет уменьшаться, и поглощение света будет наблюдаться при больших длинах волн.

Интенсивность поглощения в спектре связана с вероятностью данного типа электронного перехода. Однако далеко не все переходы, формально кажущиеся возможными, осуществляются в действительности. Существуют так называемые правила отбора, определяющие разрешенные и запрещенные переходы. Эти правила учитывают в основном симметрию молекулы, а также электронную симметрию основного и возбужденного состояний; запрещены переходы, при которых происходит изменение спина электрона. Интенсивность поглощения, соответствующего разрешенным переходам, обычно высока, мольный коэффициент погашения достигает тысяч, а иногда и сотен тысяч единиц, тогда как для запрещенных переходов значение e составляет десятки, реже - сотни единиц.

Различные области спектра дают различную информацию. УФ спектры дают важную информацию о наличии кратных и сопряженных связей, ИК спектры позволяют наблюдать многочисленные проявления различных молекулярных группировок, ЯМР- и ЭПР- спектры позволяют исследовать тонкие детали механизмов взаимодействия в реакциях. Поэтому всегда важно использовать различные спектральные методы в комплексе.

Изучение УФ спектров

Электронные уровни наглядно и с высокой точностью описываются в терминах теории молекулярных орбиталей. Исходя из деталей взаимодействия и данных о потенциалах ионизации можно расположить электроны различных молекулярных орбиталей в следующий ряд по их энергии: s. s - орбитали занимают связывающие электроны всех типов органических молекул, p- орбитали заняты электронами двойных и тройных связей, n - орбитали заполняют электроны несвязывающих электронов гетероатомов, например, кислорода или азота. Возбуждение переводит электроны на более высокие разрыхляющие орбитали, энергия которых растет p*. Таким образом, в электронных спектрах могут проявляться следующие переходы: n®p* p®p* (в алкенах, алкинах, карбонильных и азосоединениях); s®p* (в карбонильных соединениях); s®s* (в алканах).

Наличие и интенсивность проявления линии в спектре определяется вероятностью или разрешенностью соответствующего перехода. Для описания спектров используют следующие правила:

а) поглощение одного кванта сопровождается возбуждением одного электрона;

б) суммарное спиновое число при электронном переходе должно остаться неизменным.

Есть правила, учитывающие симметрию молекулы и симметрии основного и возбужденного состояний, но они не столь всеобщи. Во всех устойчивых молекулах электроны всегда спарены, возбуждение переносит электрон на более высокий по энергии уровень, но спин его остается противоположным спину электрона оставшегося. Системы, содержащие только спаренные электроны, называют синглетными ; системы, в которых присутствуют неспаренные электроны - триплетными . Переходы между синглетными или триплетными уровнями разрешены и проявления в спектрах интенсивны (триплетные уровни заселены слабо и соответствующие линии слабы только поэтому), переходы между синглетным и триплетным уровнями, наоборот, запрещены и линии, им соответствующие, малоинтенсивны.

В молекулах можно выделить структурные фрагменты, обуславливающие избирательное поглощение излучение и называемые хромофорами и фрагменты, вступающие в электронное взаимодействие с хромофорами , изменяющие таким образом интенсивность поглощения и/или положение максимума и называемые ауксохромами . Выделяют следующие типы влияния ауксохрома:

а) батохромный сдвиг - смещение полосы поглощения в сторону более длинных волн (меньших частот) или красный сдвиг;

б) гипсохромный сдвиг - смещение в сторону более коротких волн (больших частот) или синий сдвиг;

в) гиперхромный эффект - увеличение интенсивности поглощения;

г) гипохромный эффект - понижение интенсивности поглощения

УФ спектр органического вещества характеристичен, так как поглощение определяется только собственно хромофором и его ближайшим окружением, т. е. один и тот же хромофор проявляется практически одинаково как в относительно простых, так и в самых сложных молекулах. В зависимости от непосредственного окружения одной и той же хромофорной группировки положение максимума поглощения в УФ спектрах различных соединений может несколько изменяться. Сдвиг максимума в сторону более длинных волн принято называть батохромным сдвигом, а сдвиг в сторону более коротких волн - гипсохромным. Замена растворителя в отдельных случаях может вызвать некоторые изменения как в положении полос (на 2- 10 нм), так и в их интенсивности (на 10-20%).

Как правило, такая замена влияет на спектры полярных веществ и практически не сказывается на УФ спектрах неполярных соединений. Наиболее сильные изменения в спектрах обусловлены химическим взаимодействием вещества с растворителем (в частности, образованием водородной связи), а также изменением степени диссоциации или соотношения таутомерных форм вещества. Во всех таких случаях следует проверить, выполняется ли для данного раствора закон Бугера-Ламберта-Бера.

Таким образом, УФ спектроскопия позволяет определить в исследуемых соединениях группировки-хромофоры и дает прекрасную возможность для количественного анализа веществ, содержащих такие группировки. Как структурно-аналитический метод УФ спектроскопия значительно менее информативна по сравнению с другими методами и носит в основном эмпирический характер, поскольку зависимость между характером поглощения и структурой молекулы не имеет строгого физико-математического обоснования, что, однако, не мешает широкому использованию метода.

Отсутствие в УФ спектре исследуемого вещества максимума поглощения в области 200-800 нм служит надежным доказательством того, что в этом веществе не содержатся сопряженные диеновые или полиеновые системы, ароматические ядра и карбонильные группы. Этот признак часто оказывается полезным при установлении структуры соединения, например, позволяет легко различить изомеры с сопряженными и изолированными двойными связями, как в случае приводимой ниже пары:

УФ спектры основных гетероциклических соединений представлены ниже:

Таким образом, достаточно очевидны как преимущества метода (доказательство наличия в исследуемом веществе группировок-хромофоров сопряженной диеновой, полиеновой и ароматической систем, а также карбонильной группы или их отсутствия; в простейших случаях возможность определения типа хромофора, длины цепи сопряжения, числа алкильных групп при хромофоре; количественный анализ, включая регистрацию изменения концентраций растворов во времени), так и ограничения метода (ограниченность рамок применения, так как многие типы органических соединений не имеют максимума поглощения в исследуемой области; сравнительно малые возможности при решении структурно-аналитических задач; в ряде случаев сильное влияние природы растворителя на характер спектра и возможность отклонений от закона Бугера- Ламберта-Бера; фотохимическая изомеризация веществ в процессе работы (например, цис-транс- изомеризация в диеновых и полиеновых системах).

Два других вида спектроскопии, часто применяемые в органической химии, - ультрафиолетовая (УФ) спектроскопия и масс-спектрометрия (МС). В этой книге мы не будем подробно на них останавливаться и не будем заниматься интерпретацией спектров, а ограничимся лишь знакомством с основными принципами и характером информации, которую дают эти типы спектроскопии.

Ультрафиолетовая (УФ) спектроскопия изучает поглощение органическими веществами света в ультрафиолетовой области спектра (длина волны от 200 до 400 нм). Излучение с такой длиной волны поглощают только соединения, содержащие -связи (например, группы или Поглощение вызвано электронными переходами внутри молекулы. Для молекул, имеющих -связи, энергетическая разница между основным и возбужденным электронными состояниями соответствует энергии фотонов УФ-излучения. УФ-Излучение вызывает переход электронов на более высокую по энергии молекулярную орбиталь. При этом световая энергия переходит в энергию молекулы.

УФ-Спектр обычно состоит из одной широкой полосы поглощения, положение которой указывает на окружение двойной связи в молекуле. Чем большее число двойных связей в молекуле образует цепь сопряжения, тем больше длина волны поглощаемого света. Термин сопряжение означает, что две двойные связи разделены одной простой связью. В табл. 114 показано положение максимумов поглощения некоторых типичных структур. На рис. 11-22 изображен УФ-спектр -циклогексадиена.

Из табл. 11-4 видно, что появление в цепи сопряжения новой двойной связи увеличивает длину волны поглощаемого УФ-излучения примерно

Рис. 11-22. Уф-Спектр 1,3-циклогексадиена

Таблица 11-4. (см. скан) Положение максимумов поглощения УФ-излучения для некоторых соединений

на 30-50 нм. Обратите также внимание, что вещества, не имеющие двойных связей, не поглощают УФ-излучения.

Если в молекуле имеется цепь сопряжения, состоящая из семи или более двойных связей, то такое вещество поглощает видимый свет (длина волны 400-700 нм) и является окрашенным благодаря избирательному поглощению некоторых цветов.

Ультрафиолетовая спектроскопия позволяет определять число сопряженных углерод-углеродных и углерод-кислородных двойных связей в молекуле. Поглощение возникает вследствие электронных переходов.

Методы анализа антибиотиков

Активность устанавливают

Единица действия (ЕД)

Сердечные гликозиды

Витамины

Под сроком годности

Окисление

30. Рефрактометрия

Рефрактометрия

Альдегидная группа

1. + фенилгидразина гидрохлорид в виде солянокислого раствора – образование желтого хлопьевидного остатка фенилгидразона.

2. образование основания Шиффа при взаимодействии с ароматическими аминами.

На третичный атом азота

1. с осадительными (общеалкалоидными) реактивами : Вагнера, Майера, Драгендорфа, раствором пикриновой кислоты, а также с раствором дихромата калия.

На атом фосфора

1. Фосфат-ионы образуют с раствором молибдата аммония желтый осадок фосфор-молибдата.

Количественное определние

Фенольный гидроксил

1. + хлорид железа (III). Растворы (водные, спиртовые или ацетоновые) приобретают зеленое окрашивание.

2. Азосочетание.

3. Обр-ие ауринового красителя

Нитрогруппа

1. После гидрирования нитрогруппы в молекуле нитроксолина до ароматической аминогруппы, выполняют реакцию диазотирования и азосочетания со щелочным раствором β-нафтола. Появляется красно-оранжевое окрашивание.

2. + дифениламин в присутствии концентрированной серной кислоты (синее окрашивание).

3. + гидроксид натрия – образуется ацисоли (красно-оранжевое окрашивание).

Третичный атом азота

1. при нагревании в растворе лимонной кислоты и уксусном ангидриде, то появляется пурпурно-красное окрашивание.

2. с осадительными (общеалкалоидными) реактивами : Вагнера, Майера, Драгендорфа, раствором пикриновой кислоты, а также с раствором дихромата калия (желтый осадок).

Нитроксалин образует окрашенные внутрикомплексные соединения с катионами металлов: магния, кадмия, меди (II), цинка, алюминия.

Количественное определние

Нитроксолин определяют методом неводного титрования, используя в качестве растворителя уксусный ангидрид и титранта - 0,1 М раствор хлорной кислоты. Определение нитроксолина выполняют в присутствии муравьиной кислоты и индикатора малахитового зеленого, а определение хлорхинальдола проводят с индикатором кристаллическим фиолетовым.

Сложноэфирная группа

1. гидроксамовая проба

2. + гидроксид натрия

Фенольный гидроксил

1. + хлорид железа (III) и a,a-дипиридил в смеси этанола и бензола. Появляется красное окрашивание.

2. реакции окисления, сопровождающиеся образованием окрашенных веществ.

1 – при нагревании до 80 C с концентрированной азотной кислотой происходит образование окрашенного в красно-оранжевый цвет.

2 – при добавлении гексацианоферрата (III) калия в щелочной среде образуется окрашенный продукт.

3 – соли церия (IV), железа (III), происходит окисление токоферола до о-, n -токоферилхинона, образование которого обусловливает желтое окрашивание.

Эту химическую реакцию используют для количественного определения токоферола ацетата. Определение основано на кислотном гидролизе (кипячением с обратным холодильником в присутствии серной кислоты). Затем выделившийся токоферол титруют сульфатом церия (IV) (индикатор дифениламин) до появления сине-фиолетового окрашивания.

Производные птеридина

Птеридин - гетероциклическая система, состоящая из двух конденсированных гетероциклов пиримидина и пиразина:

К этой группе относится: Фолиевая кислота.

Кислоту фолиевую хранят в хорошо укупоренной таре, в сухом, темном месте, так как она гигроскопична и разлагается под действием света. Особенно быстро процесс разложения происходит в кислой среде в растворах под воздействием ультрафиолетового излучения.

Требования к условиям хранения различных групп ЛВ находятся в зависимости от их физико-химических свойств и воздействия различных факторов внеш­ней среды. Они регламентируют­ся «Инструкцией по организации хранения в аптечных учреждениях различных групп лекарственных средств и изделий медицинского назначения», утвержденной приказом МЗ РФ №377 от 13 ноября 1996 г.

Метод осаждения

Навеску анализируемого вещества растворяют в воде или другом растворителе и осаждают определяемый элемент реактивом в виде малорастворимого соединения. Полученный осадок отфильтровывают, промывают, высушивают, прокаливают и взвешивают. Зная массу осадка, вычисляют содержание определяемого элемента в массовых долях или процентах от взятой навески.

Осажденной формой называют соединение, в виде которого определяемый компонент осаждается из раствора.

Гравиметрической (весовой) формой называют соединение, которое взве­шивают.

Метод выделения

Основан на выделении определяемого компонента из анализируемого вещества и его точном взвешивании.

Метод отгонки

В этом методе определяемый компонент выделяют в виде летучего соединения действием кислоты или высокой температуры.

· Прямая отгонка (определяемый компонент выделяют из пробы в виде газообразного продукта, улавливают и затем определяют его мас­су).

· Косвенная отгонка (массу газообразного продукта определяют по разности масс анализируемого компонента до и после термической обработ­ки).

В практике фармацевтического анализа этот метод широко применяется при определении влажности лекарственных препаратов, растительного сырья.

Методы анализа антибиотиков

Активность устанавливают диффузионным или турбидиметрическим методами . ГФ XI рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, заключающийся в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм.

Поскольку состав агаровой среды и условия выполнения биологиче­ского испытания одинаковы, величина зоны диффузии (в которой развитие тест-микроорганизма подавляется антибиотиком) зависит только от химической природы антибиотика и его концентрации.

Единица действия (ЕД) представляет собой меру, кото­рой выражается биологическая активность антибиотиков. За ЕД при­нимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды.

К ускоренным микробиологическим методам относят методы, осно­ванные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест-микроорганизмов (уреазный метод).

Сердечные гликозиды - безазотистые соединения растительного происхождения, характеризующиеся кардиотоническим действием. Данные препараты играют исключительно важную роль в терапии больных с острой и хронической сердечной недостаточностью любого генеза. При определении активности лекарственного сырья и многих препаратов сердечных гликозидов используют биологическую стандартизацию. Наиболее часто активность сердечных гликозидов выражают в лягушачьих единицах действия (ЛЕД) и кошачьих единицах действия (КЕД). Одна ЛЕД соответствует минимальной дозе стандартного препарата, в которой он вызывает остановку сердца у большинства подопытных лягушек, кошек, голубей. Так, размельченный порошок листьев наперстянки по активности соответствует такой пропорции: один грамм порошка листьев равен 50-66 ЛЕД или 10-13 КЕД. В процессе хранения активность листьев уменьшается.

Витамины представляют собой группу веществ различной химиче­ской структуры, необходимых в малых количествах для нормальной жизнедеятельности организма. Ряд витаминов входят в состав фер­ментных систем и являются своеобразными биологическими катализа­торами химических или фотохимических процессов, происходящих в живой клетке (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, пантотеновая кисло­та и др.).

Для качественной и количественной оценки витаминов в природ­ных источниках используют как биологические, так и физико-химиче­ские методы. Принцип оценки биологической активности заключается в том, что животных (крыс, голубей, морских свинок) переводят на диету, содер­жащую белки, жиры, углеводы, минеральные соли и все витамины, кроме исследуемого. Затем устанавливают, какое количество испытуемого витамина может излечить или предохранить животное от авита­миноза. Параллельно проводят аналогичное испытание со стандартным препаратом.

Биологический метод оценки активности витаминов очень трудо­емок, точность его сравнительно невелика. Поэтому для испытания подлинности и количественного определения витаминов обычно ис­пользуют физические, химические и физико-химические методы.

28. Стабильность и сроки годности ЛС (влияние влаги, CO 2 , света, кислорода воздуха, примесей).

Под сроком годности лекарственных средств понимают период времени, в течение которого они должны полностью сохранять свою терапевтическую активность, безвредность и по уровню качественных и количественных характеристик соответствовать требованиям ГФ или ФС (ФСП), в соответствии с которыми были выпущены и хранились в условиях, предусмотренных указанными статьями.

По истечении срока годности ЛС не может быть использовано без переконтроля качества и соответствующего изменения установлен­ного срока годности. Существует определенная взаимосвязь между понятием «срок годности», имеющим временной смысл, и понятием «стабильность», обусловливающим качество ЛС (его устойчивость).

Температура – с увеличением увеличивается скорость реакции; с понижением (понижается активность MgSO 4 , CaCl 2 , раствора адреналина).

Свет – повышается скорость разложения; кристаллические сухие вещества более устойчивы, чем растворы; изменение цвета при длительном освещении; некоторые вещества сохраняют свою активность (содержащие железо, при этом повышается их стабильность).

Влага – снижает фармакологическую активность; + и – влияет на ЛВ; гигроскопичность.

Окисление - процесс, являющийся одной из причин разложения ЛВ. Некоторые из них (производные фенолов) окисляются, находясь в кристаллическом состоянии. Процесс окисле­ния заметно активизируется при растворении. Особенно легко окисляются ЛВ, проявляющие активные восстановитель­ные свойства (альдегиды, гидразиды, производные фенотиазина и др.).

Система мер, направленных на предохранение ЛВ от окисления, сводится прежде всего к уменьшению влияния атмосферного кислорода или максимальному удалению примесей, катализирующих процесс окисления. Используя окислители, можно смоделировать процесс окисле­ния. Если затем сравнить полученные продукты окисления стандарт­ного образца и продукты разложения ЛВ, то можно сделать заключение о механизме процесса окисления. Это позволяет решать вопрос о путях стабилизации, так как станут известны факторы, вли­яющие на скорость реакции окисления.

Методы повышения стабильности:

1) физические (твердые вещества – в плотно укупоренной таре; суспензии – в сухом состоянии; инъекции – в ампулах запечатанных);

2) химические (окисление, металлы).

29. Фармакокинетика и биодоступность.

Фармакокинетика – раздел фармакологии о всасывании, распределении, депонировании, метаболизме и выделении ЛВ.

Проведение фармакокинетических исследований возможно только на основе применения современных методов биофармацевтического анализа, позволяющих проследить процесс всасывания и распределения ЛВ в орга­нах и тканях. Они включают выяснение влияния различных биофар­мацевтических факторов на терапевтическую эффективность ЛВ; изучение их биологической доступности и разработку методов ее определения; создание способов определения ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях.

На фармакокинетику ЛВ оказывают влияние различные факторы: воз­растные, генетические, половые, масса тела, питание, беременность, а также различные патологические процессы, например заболевания печени, почек, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, эндокринные, инфекционные и другие заболевания.

Биодоступность – количество неизменного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата.

Одним из основных этапов любого исследования биологической доступности ЛС является использование биофар­мацевтического анализа для определения концентрации ЛВ (метаболита) в биологических жидкостях.

30. Рефрактометрия

Рефрактометрия основана на наличии зависимости величины показателя преломления света от концентрации раствора испытуемого вещества. Показатель преломления зависит также от температуры, длины волны света, концентрации вещества и природы растворителя. Рефрактометрию используют для установления подлинности лекарственных веществ по молярной рефракции. Для количественного определения выбирают интервал линейной зависимости между концентрацией раствора и коэффициентом преломления. В этом интервале концентрацию (х) вычисляют по формуле: х=(n – n O)/F, где n - показатель преломления раствора вещества; n O - показатель преломления растворителя; F - фактор, равный величине прироста показателя преломления при увеличении концентрации вещества на 1% (устанавливается экспериментально).

Рефрактометрические определения выполняют на рефрактометрах, при стабильной температуре (20±0,3 О C) и длине волны линии D спектра натрия (589,3 нм) в диапозоне показателей преломления от 1,3 до 1,7. Прибор юстируют по эталонным жидкостям или воде очищенной, для которой n D 20 = 1,3330.

Спектрофотометрия в УФ-, видимой, ИК-областях спектра в оценке качества ЛС.

Используют спектрофотометрические методы анализа по поглощению веществами монохроматического электромагнитного излучения.

Фотометрические методы анализа основаны на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера:

В случае несоответствия закону вначале с помощью стандартного раствора устанавливают зависимость оптической плотности от концентрации, а затем строят калибровочный график, с помощью которого выполняют расчеты.

Диапазоны света:

Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях – 1 из широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе.

Анализируемые ЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обусловливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.

Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называется спектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой. Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в УФ (190-380 нм) и видимой (380-780 нм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щело­чей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.

Удельный показатель поглощения представляет собой величину оптической плотности раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора, измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандартному образцу величину E и преобразовав эту формулу, можно рассчитать концентрацию анализируемого вещества с относительной погрешностью до ±2%.

Константа измеряется в различных единицах; в молях – молярный коэффициент поглощения, в % - удельный показатель поглощения

Идентификацию ЛВ можно провести по, Е, характеру спектральных кривых в различных растворителях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.

Спектрофотометрия в ИК-области. Природа полос поглощения в ИК области связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества. Поэтому поглощением в ИК-области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуждении колебательных движений ядер. Область применения ИК-спектроскопии аналогична, но более широка, чем у УФ-метода. ИК-спектр однозначно ха­рактеризует всю структуру молекулы, включая незначительные ее изменения. Важные преимущества ИК-спектроскопии - высокая специфичность, объективность полученных результатов, возможность анализа веществ в кристаллическом состо­янии. Для измерения ИК-спектров на однолучевых или двулучевых ИК-спектрофотометрах используют взвеси веществ в вазелиновом масле или помещают анализируемое вещество между пластинами из бромида калия.

Каждый ИК-спектр представляет собой серию полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом, измеряемым в см -1 , и определенной интенсивностью. Для анализа ЛB обычно используют спектральную область от 4000 до 400 см -1 .

ГФ XI рекомендует два способа установления подлинности по ИК-спектрам. Один из них основан на сравнении заре­гистрированных в идентичных условиях ИК-спектров испытуемого ЛB и его стандартного образца. Второй способ заклю­чается в сравнении ИК-спектра испытуемого ЛB с его стандартным спектром, прилагаемым к ФС и зарегистрированным в соответствии с указанными в ней требованиями.