Выбор читателей
Популярные статьи
Совместное культивирование лимфоцитов, имеющих молекулы МНС-II разного гаплотипа, вызывает их бласттрансформацию и пролиферацию. Реагирующие клетки относятся к Т-лимфоцитам и стимулируются чужеродными MHC-II детерминантами, расположенными на В-лимфоцитах, макрофагах. Сила реакции зависит от степени различия между антигенами гистосовместимости. Для оценки реактивности индивидуума в отношении аллельного варианта МНС готовят однонаправленную культуру лимфоцитов. Для этого клетки-стимуляторы предварительно обрабатывают митомицином или облучают, при этом стимулирующие клетки теряют способность к делению, но сохраняют жизнеспособность.
Реактивность в смешанной культуре лимфоцитов является од-ним из критериев в оценке клеточного иммунитета. СКЛ позволяет провести типирование HLA, подобрать пару донор-реципиент при трансплантациях тканей и органов, провести корреляцию между HLA-антигенами и определенными заболеваниями.
Для постановки реакции используют взвесь лимфоцитов, выделенных из крови пациентов (донора и реципиента). Отмытые отвечающие клетки суспендируют в небольшом количестве среды 199 (0,5 мл) и после подсчета количества клеток доводят до 0,6 * 10 6 клеток/мл. Суспензию стимулирующих клеток приготовят аналогично с добавлением раствор митомицина С (500 мкг митомицина С в 1 мл забуференного физраствора) из расчета 0,1 мл на 1 мл суспензии. Клеточную смесь инкубируют 40 минут при 37 °С на водяной бане, помешивая, затем к суспензии добавляют холодную среду 199 и трижды отмывают клетки при центрифунировании. Осадок суспендируют в питательной среде культивирования, доводя количество клеток до 0,6 * 10 6 клеток/мл.
В лунки стерильного круглодонного иммунологического планшета внесят по 0,1 мл клеточной суспензии в растворе Хенкса и добавляют 0,1 мл клеточной суспензии, несущей аллельные варианты МНС. В контроль добавляют такое же количество раствора Хенкса.
Учет результатов проводят после инкубировать клеток при 37 °С 3-5 суток в зависимости от постановки реакции с использованием морфологического или изотопного метода (см. РБТЛ).
При трансплантации костного мозга выбор гистосовместимого донора проводится по результатам HLA-типирования донора и реципиента, а также при определении совместимости отобранных HLA-идентичных пар донор-реципиент в СКЛ, которая является финальным этапом оценки совместимости. Для этого используется постановка двунаправленной реакции СКЛ с использованием культурального микрометода в 96-луночной планшете с оценкой величины пролиферации по включению радиоактивного Н 3 -тимидина в ДНК пролиферирующих лимфоцитов.
Вторая часть эфира 2 июля.
HLA-гены и иммунология репродукции. Кожный лоскут. Иммунизация лимфоцитами (ЛИТ). СКЛ - смешанная культура лимфоцитов. Иммунологический фактор при невынашивании беременности.
HLA-гены и иммунология репродукции
Так какая же система самая разнообразная внутри организма и что обеспечивает защиту от инфекций? Это система генов иммунитета - HLA-гены. Все эти гены располагаются на 6-й хромосоме и определяют индивидуальность иммунного ответа, чувствительность к тем или иным стимулам.
Вот здесь как раз речь заходит об иммунологии репродукции
, о том, чем занимается наш Центр. Если смотреть наш сайт, то можно увидеть, что существует так называемый аллоиммунный
фактор бесплодия и невынашивания беременности. Он связан с антигеном тканевой совместимости, с похожестью или непохожестью по антигенам тканевой совместимости. Риски в репро-дуктивном процессе профессора-имунолога Валентина Ивановича Гавалло, который является родоначальником иммунологии репродукции в нашей стране.
Иммунология репродукции не сразу развивалась, как отдельное направление. Иммунологов всегда интересовало множество других вещей, а иммунология репродукции была интересна в последнюю очередь. Но всё же, в процессе развития в этой области медицины, иммунология репродукции сформировалась в отдельное направление. В какой-то момент было найдено, что есть определённые вещества, которые назвали антигенами тканевой совместимости
или главным комплексом гистосовместимости
, или системой антиген-лейкоцитов человека
. Если эти компоненты совпадают у людей, то можно пересаживать органы и они будут приживаться в новом теле.
Кожный лоскут
Оказывается, что если во время беременности идёт непохожесть между плодом и матерью по антигенам тканевой совместимости, то в организме матери возникает ответ на эти антигены. Тогда в крови матери (и вообще, в крови рожавших женщин) можно обнаружить огромное количество антител против антигенов тканевой совместимости, которые плод наследовал от отца. И находясь внутриутробно, плод вызывал на себя иммунный ответ организма матери.
Исследователями было высказано предположение, что действие этих антител на плод очень вредно, так как в некоторых случаях они повреждали и убивали его. Такие случаи называют «привычное невынашивание беременности».
Для лечения этих случаев и сопутствующих осложнений нашли такой способ: у мужа брали лоскут кожи и подсаживали женщине, чтобы этот лоскут был иммуносорбентом
вредных антител, образовавшихся во время предыдущих беременностей. Тогда у плода появлялась возможность спокойно развиваться. Такое лечение невынашивания беременности начали проводить в Америке, в Чехословакии, и далее, в Европе, и оно действительно работало.
В какой-то момент и в России, в Москве решили заниматься таким лечением. В Институте акушерства и гинекологии была создана лаборатория клинической иммунологии, заведующей которой стала Лидия Сергеевна Волкова. Она обратилась с предложением сотрудничества к молодому тогда ещё Валентину Ивановичу Говалло, который простажировался в Чехословакии у Гашека, известного иммунолога-трансплантолога; и посетил лабораторию Дассе в Париже. Гавалло начал разработку систем тканевого типирования ещё в Институте травматологии и ортопедии, и проводил эксперименты по пересадке кожных лоскутов на мышах.
Одной из первых пациенток стала женщина, у которой ранее было 15 выкидышей. Сама беременность наступала у неё легко, но потом она не могла её выносить. И было проведено ей вышеописанное лечение с подсадкой кожного лоскута мужа, которое тоже прошло успешно. А после этой беременности у пациентки были ещё две последующие удачные беременности. И в то время данный случай просто потряс врачей, проводивших это лечение. С тех пор эта методика начала широко применяться в России и в сопредельных государствах.
Иммунизация лимфоцитами
А иммунология репродукции продолжала развиваться. Скоро поняли, что упомянутые кожные лоскуты - не сорбенты, а иммуностимуляторы,
вызывающие на себя реакцию отторжения. А эта методика - как раз та самая иммунизация, в процессе которой формируются антитела. И эти антитела - не повреждающего, а защитного характера. Они помогают вовремя распознать беременность внутри полости матки и включить на эту беременность адекватную реакцию, направленную на сохранение и выживание плода. Далее последовало совершенствование этой методики. Где-то на рубеже 70-80-х годов В.И.Говалло на одной конференции в Новосибирске задался вопросом о необходимости пересадки кожного лоскута. Гораздо проще, говорил он, взять из крови мужа лимфоциты
(клетки, имеющие на себе высокую концентрацию антигенов тканевой совместимости второго класса) и просто ввести их женщине. И дальнейший результат будет таким же. После конференции с ним связалась профессор Сидельникова, заведующая отделением невынашивания беременности, и предложила начать проводить процедуры иммунизации пациенток предложенным им способом.
И они стали проводить такие процедуры, а их пациентки стали успешно вынашивать беременность. А затем случилось так, что Валентин Иванович поссорился с профессором Сидельниковой, они стали работать отдельно и возникли два способа лимфоцитоиммунизации.
В Центре акушерства и гинекологии процедуру проводили, вводя препарат многократно в небольших количествах.
А по методу Говалло лимфовзвесь вводилась однократно в количестве 200-250 миллионов клеток, и наш Центр выбрал этот метод, хотя оба способа хорошо работают.
СКЛ - смешанная культура лимфоцитов
Валентин Иванович был основным нашим консультантом при создании и открытии клиники, помогал запустить свою методику у нас. Сейчас мы типируем пациентов на гены тканевой совместимости второго класса. При обнаружении такой похожести – делаем иммунизацию лимфоцитами мужа, только мы добавили сюда ещё и смешанную культуру лимфоцитов (СКЛ)
.
Объясню, почему. Когда ещё я работал на кафедре и учился в аспирантуре, где-то в конце 80-х годов, нашей клинической базой был 7-й роддом, самый близкий к Кремлю, на Воздвиженке. После занятий я шёл в библиотеку имени Ленина и просматривал все новинки в публикациях из разных стран мира.
Одной из них было интересное многотомное «Руководство по акушерству и гинекологии» из Германии, где невынашиванию беременности был посвящен отдельный том. И в этом томе была целая глава по иммунологии невынашивания беременности, где предлагалось использовать смешанные культуры лимфоцитов для выявления пар, которым действительно нужна иммунизация, и отсекать тех, кому не нужна эта процедура. Таким образом я знал про эту дополнительную методику и стал использовать в наших клиниках, хотя многие не применяют её из-за некоторой сложности. У нас в Центре это отдельная программа по аллоиммунному бесплодию.
Иммунологический фактор при невынашивании беременности: роль совпадений по HLA
Но замечу, что не стоит гипертрофировать проблему иммунологического фактора при невынашивании беременности. Да, он значим, но не является единственной проблемой невынашивания.
Здесь немного вернемся опять к истокам генетики. В какой-то момент развития теорий о половом размножении возникла эта идея про совместимость по тканевым антигенам. Потому что половое размножение даёт разнообразие прежде всего по антигенам тканевой совместимости, по антигенам белков иммунной системы. И тогда решили найти такую популяцию, где приветствуется многодетность, где не используют контрацепцию, и где ведут здоровый образ жизни. Чтобы легче было выявить факторы, влияющие на наступление и течение беременности. И нашли подходящую популяцию в виде христианской общины хаттеритов (Гуттерово братство).
В такой популяции имеется полная похожесть супругов по антигенам тканевой совместимости второго класса. И среди их супружеских пар было выявлено, что там увеличен период между началом половой жизни и рождением первого ребёнка; увеличено количество случаев невынашивания беременности; и увеличены интервалы между рождением детей. При этом нет случаев бесплодия. И почти во всех таких супружеских парах более 10-ти детей.
Из этого исследования можно сделать вывод, что всё-таки влияние фактора тканевой совместимости ограничено. Поэтому, когда у нас есть пара с похожестью генов тканевой совместимости (а таких пар всего примерно 15%) в сочетании с невынашиванием беременности, нужно проводить более углубленные обследования по всем направлениям, касающимся невынашивания беременности. Тогда точно может быть выявлена необходимость проведения процедуры лимфоцитоиммунизации.
Большое внимание в настоящее время уделяется исследованию роли иммунных механизмов в репродуктивном процессе, поскольку их нарушение приводит к развитию бесплодия и раннему прерыванию беременности. Исследования иммунологических параметров и их взаимосвязи с репродуктивными процессами позволили сделать вывод о необходимости перестройки иммунной системы при подготовке организма матери к беременности, начиная с овуляторного периода, в момент имплантации эмбриона и в ранний период беременности.
Одной из наиболее сложных и трудно диагностируемых причин бесплодия и повторяющихся спонтанных выкидышей являются иммунные дисфункции.
С целью своевременного выявления иммунологическог о бесплодия в лаборатории иммунологии репродукции проводится обследование супружеских пар с использованием следующих методов диагностики:
Консультация необходима:
При выявлении нарушений с целью иммунокоррекции нарушений назначается процедура аллоиммунизации лимфоцитами партнера (АИЛ) . Данный метод лечения разрешен к применению Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения (лицензия ФС№2009/179 от 02.07.2009)
Процедура проводится только при наличии у партнера отрицательных результатов анализа на ВИЧ-инфекции, сифилис и вирусные гепатиты (В, С). Осложнения при АИЛ не выявлено. Метод АИЛ обладает выраженным иммунокорригирующим эффектом, повышает эффективность лечения бесплодия, как в естественном цикле, так и при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО). Также назначается при неудачных попытках экстракорпорального оплодотворения.
АИЛ проводится 1 раз в 28-30 дней (в соответствии с менструальным циклом женщины) в 1-ую фазу цикла. Первый курс включает 3 процедуры АИЛ. После 2-ой процедуры пара повторно сдает контрольный анализ. При наличии позитивной динамики третья процедура АИЛ является последней. При отсутствии динамики — доза клеток для иммунизации увеличивается и проводится 2-ой курс, включающий 2 процедуры. После контрольного анализа в некоторых случаях необходимо назначение 3 курса иммунизации с увеличением дозы клеток. После достижения нормативных значений позитивный эффект держится в пределах 6-8 месяцев.
За период с 2003 по 2013гг. в лаборатории клеточной иммунотерапии было проведено около 3000 процедур аллоиммунизации лимфоцитами партнеров. Для данной процедуры из крови партнера выделяются только лимфоциты, которые всегда присутствуют в спермальной жидкости. В других странах* на протяжении 20 лет также проводится процедура аллоиммунизации, которая помогает женщине выносить и родить здорового ребенка.
Вид услуги | Цена, руб. |
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 1в-во) | 1650 |
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 2в-ва) | 2 900 |
Тест трансформации лимфоцита (Выявление сесибилизации на 3в-ва) | 3 900 |
Тест трансформации лимфоцита (иммунологическое обследование при бесплодии) | 3 200 |
Иммунограмма расширенная с активационными маркерами | 4 625 |
Комплексное исследование иммунного статуса | 4 125 |
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 1 доза) | 1 900 |
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 2 доза) | 2 750 |
Вакцинация (аллоиммунизация лимфоцитами партнера 3 доза) | 3 400 |
ИсследованиеCD16+/CD56+ лимфоцитов(иммунологическое обследование при бесплодии только НК-клетки) | 1 250 |
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды макрофагов) | 9 400 |
Исследование макрофагальной активности (кондиционные среды) | 1 500 |
Криоконсервирование мононуклеаров для аллоиммунизации | 650 |
Первые сообщения о смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) появились в 1964 г. в связи с феноменом бластрансформации. Изучение СКЛ основано на том же принципе, что и реакции бласттрансформации лимфоцитов (см. раздел «Реакция бласттрансформации лимфоцитов »). Сила реакции зависит от степени различия между антигенами гистосовместимости. HLA-A, -В-В- и -С-антигены на поверхности лимфоцитов соответствуют HLA-D-антигенам, которые могут быть выявлены только при помощи СКЛ. В то же время DR-антигены (D-related) могут быть обнаружены при помощи антисывороток (см. раздел «Комплементзависимая цитотоксичность. Типирование по HLA-DR.»). Гипотеза о том, что анти-DR-сыворотки позволяют осуществлять тонкое типирование всего локуса D, кажется в настоящее время менее вероятной, чем гипотеза о существовании двух различных локусов.
Хромосома 6 человека с HLA-комплексом и близко расположенными локусами (GLO; PGM 3).
В настоящее время точно установлено существование 12 антигенов DW и 10 антигенов OR. LD - 2 = минорный D-локус, существование которого можно предположить на основании рекомбинационного анализа
Даже для Iа-антигенов человека в настоящее время обсуждается трехлокусная модель, так что термин «DR» не следует более применять в качестве синонима понятия «человеческие молекулы II класса».
Для оценки реактивности (индивидуума) в отношении аллогенного раздражителя готовят так называемую одностороннюю СКЛ, при которой для стимуляции используют инактивированные клетки. Следует заметить, что даже инактивированные стимулирующие клетки (см. ниже) обладают способностью выделять митогенные факторы, а также до некоторой степени усиливать синтез ДНК и биосинтез иммуноглобулинов. Это может стать скрытым источником ошибок. На мышиной модели хорошо изучены взаимодействия, возникающие в ходе аллогенной реакции.
Механизм индукции аллогенной реакции для получения эффекта зависимого от клеток лимфоцитолиза (модификация описана в соответствующей работе)
MF - макрофаг; T lNDH -индуктор хелперных клеток; Т н - Т-хелпер; рТ с - предшественник цитотоксической клетки; Т с - цитотоксическая клетка; треугольник- DR-антиген; прямоугольник - HLA-A/B-антигены
Правда, до настоящего времени остается неясным, какие типы клеток участвуют в пролиферативном ответе. Исследование первичной реакции лимфоцитов на аллогенные клетки используется в следующих случаях:
Проверка СКЛ-реактивности в качестве критерия оценки клеточного иммунитета;
Типирование HLA-D;
Выяснение взаимозависимости между HLA-D-антигенами и предрасположенностью к определенным заболеваниям;
Выбор пары донор - реципиент.
В основе почти всех методов клеточных взаимодействий, используемых клинической иммуногенетикой, лежит феномен бластооб- разования в смешанной культуре лимфоцитов, открытый канадской исследовательницей Барбарой Бейн . Реакция смешанной культуры лимфоцитов (mixed lymphocyte culture - MLC) позволила осуществить тонкое дифференцированное изучение комплекса HLA и, в частности, одной из его субъединиц - локуса HLA-D. Ряд других методов клеточных взаимодействий - клеточно-опосредованный лимфолизис (Cell-mediated Lympholysis - CML), тест примирования лимфоцитов (Primed Lymphocyte Typing) - основывается на методе MLC или содержит его как составную часть.
Принцип метода изображен на рис. 10, из которого видно, что две популяции различающихся генетически лимфоцитов взаимодействуют между собой в культуре in vitro. Одна из популяций обрабатывается митомицином С или облучается, в результате чего теряет способность к бластообразованию и включению тимидина (3 НТ), однако, не теряя антигенных свойств, сохраняет способность к стимуляции (стимуляторы; S-популяция).
Клетки, отвечающие на стимуляцию (респондеры, R-популяция), через несколько дней трансформируются в бласты и включают тимидин, добавляемый в культуру. Интенсивность реакции измеряется с помощью радиационной метки по включению 3 Н-тимидина.
Известны несколько вариантов реакции смешанной культуры лимфоцитов, из которых здесь предлагаются два: традиционный и микровариант, реализуемый в планшетах Cook (рис. 11).
Рис. 11. Оборудование для микровариантов MLC и CML. 1 - планшет круглодонный е 96 лунками; 2-автоматическая пипетка ("Pipetman") с программой для разных объемов; 3 - автоматическая пипетка ("Sigma") для определенного объема; 4 - наконечник для пипетки одноразового использования; 5 - ламинарный бокс
Традиционный вариант MLC (модификация Ф. С. Барановой):
Лимфоциты выделяют на фиколл-урографиновом градиенте, как описано выше. Первую отмывку производят в PBS (NaCl - 8,0 г, Na 2 HP0 4 - 1,15 г, KH 2 PO 4 - 0,2 г, KC1 - 0,2 г на 1л H 2 O); две последующие производят в среде 199 с 5%-АВ-сыворотки (пул от 15 доноров);
Отвечающие клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ и доводят концентрацию клеток до 0,6 x 10 6 в 1 мл;
Выделенные таким же образом стимулирующие клетки в концентрации 5 - 10 6 в 1 мл обрабатывают митомицином С (60 γ/мл) фирмы "Serva" и инкубируют 40 мин при 37°С в водяной бане. После инкубации клетки отмывают 3 раза средой 199 с 5% сывороткой АВ, ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ, доводя концентрацию до 0,6 x 10 6 в 1 мл;
0,5 мл отвечающих клеток и 0,5 мл стимулирующих клеток смешивают в центрифужной пробирке, прибавляют 0,04 мл 10 мл р-ра Hepes ("Serva") и инкубируют 144 ч; опыт ставят в трех параллелях (триплет);
За 24 ч до окончания инкубации в пробирки добавляют 3 Н-тимидин 1μCi (3,7x10 4 БК), на пробу удельной активности 5mСi/мМоль (18,5x10 7 БК/мМоль) и продолжают инкубацию;
По окончании инкубации клетки переносят на миллипоровые фильтры (0,6 - 0,9 микрон), промывают физиологическим раствором (37°С) и охлажденным 5% раствором трихлоруксусной кислоты (4°С). Фильтры сушат и помещают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкостью (5 г РРО и 0,5 г РОРОР - на 1 л толуола) * . Активность включения 3 Н-тимидина замеряют на β-счетчике; результат выражают в абсолютных включениях радиоактивной метки в 1 мин или в индексе стимуляции (ИС) по формуле:
* (РРО - 2,5-фенол-оксазол; РОРОР - (1,4-ди-2-15-фенолоксазолитбензол). )
Среднее значение СРМ в трех опытных образцах
ИС = Среднее значение СРМ в трех контрольных образцах/Контрольными образцами служат спонтанные культуры отвечающих клеток.
Микровариант MLC в планшетах Cook . На 8-м Уоркшопе выработаны требования, стандартизирующие микровариант MLC, в соответствии с которыми он излагается ниже :
Лимфоциты выделяют в градиенте изопак-фиколла и ресуспендируют в среде RPMJ-1640 * , доводя концентрацию до 5х10 5 в 1 мл;
* (Можно использовать среду 199, смешанную с человеческой сывороткой группы АВ (5% сыворотки, взятой от нескольких индивидов). )
Клетки-стимуляторы обрабатывают митомицином С или обучением;
5x10 4 репондеров и столько же стимуляторов помещают с помощью микропипетки типа Pipetman в каждую лунку круглодонного микропланшета Cook;
Планшеты инкубируют в термостате с автоматической подачей 5% CO 2 в течение 120 ч; затем в каждую лунку вносят lμmCi 3 Н-тимидина при специфической активности тимидина 6 Ci/мМоль; все манипуляции проводят пипеткой Pipetman;
Через 16 ч после внесения тимидина культуры из каждой лунки автоматической пипеткой переносят на миллипоровые фильтры и промывают физиологическим раствором, а затем 5% трихлоруксусной кислотой; удобно использовать специальные "харвестеры" для переноса культуры на миллипоровые фильтры;
Активность включения тимидина определяют, как описано выше.
CML используется в иммуногенетических исследованиях сравнительно недавно (с 1972 г.), однако в последнее время становится все более популярной техникой, позволяя детально изучить роль эфферентного звена трансплантационного иммунитета и завоевывая признание как информативный метод иммунологического мониторинга. Принцип метода изображен на рис. 12. В основе метода лежит техника, предложенная J. Lightbody (1971), которая вкратце сводится к следующему.
1. CML начинается с обычного HLC-теста, в котором происходит распознавание отвечающими клетками "стимуляторов", сенсибилизация отвечающих клеток и формирование сенсибилизированных киллеров.
2. Вторая фаза, в которой сенсибилизированные киллеры смешиваются с меченными 51 Сr клетками-мишенями, состоит в деструкции последних эффекторными клетками-киллерами; клетки- мишени могут иметь генотип такой же, как "стимуляторы" в первой фазе MLC, а могут быть клетками "третьего" партнера", наделенными общими со "стимуляторами" антигенными детерминантами или без них.
3. Количество радиоактивного хрома, высвобождающегося из разрушенных клеток-мишеней и выходящего в культуральную среду, служит мерой интенсивности киллер-эффекта.
Рис. 12. Принцип клеточно-опосредованного лимфолизиса (CML). I ряд - сенсибилизация отвечающих клеток, образование киллеров; II ряд - взаимодействие киллеров с мишенью; III ряд - разрушение клетки-мишени; выход 51 Cr культуральную среду
Здесь описано три варианта CML: традиционный вариант в модификации Л. П. Алексеева (1979), микровариант в планшетах Cook, прямая CML (Direct-CML -D-CML.
Традиционный вариант [Алексеев Л. П., 1979].
Метод разделен на несколько этапов.
Получение киллеров :
Периферические лимфоциты обеих популяций (R-клетки и S-клетки) выделяют обычным путем, в градиенте плотности отмывают трижды в среде 199 с 5% АВ-сывороткой (10 мин, 150 g);
1x10 6 R-клеток (0,8 мл) смешивают в центрифужных пробирках с 2x10 6 S-клеток (0,2 мл), обработанных митомицином С, и инкубируют 144 ч при 37°С;
Клетки центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 20% телячьей сыворотки (среда 199 + т. е.), доведя концентрацию до 1x10 6 в 1 мл;
Одну из проб оставляют для исследования уровня MLC, остальные используют как готовые киллеры.
Получение мишеней :
Выделенные обычным путем лимфоциты ресуспендируют в среде 199 с 20% АВ-сывороткой и инкубируют с фитогемагглютинином (0,003 мг/мл Wellcome) в течение 72 ч при 37°С; концентрация клеток 1x10 6 в 1 мл;
Клетки центрифугируют 10 мин при 150 g, осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой и доводят концентрацию клеток до 2x10 4 в 1 мл;
К взвеси добавляют 51 Cr 100 μCi/мл (3,7x10 6 БК/мл) и инкубируют 40 мин при 37°С;
Клетки трижды отмывают в среде 199 с добавкой 5% АВ-сыворотки (150 g, 10 мин) и осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой,. доведя концентрацию до 2x10 4 в 1 мл.
Постановка реакций :
5x10 5 киллеров (0,5 мл) смешивают с 1x10 4 мишеней (0,5 мл), инкубируют 4 ч (37°С) и центрифугируют при 150 g 10 мин;
Суспернатант отсасывают и на?-счетчике подсчитывают импульсацию, вызываемую 51 Cr; подсчет ведут в 0,5 мл супернатанта;
Уровень цитолиза подсчитывают по следующей формуле:
экепер. выход 51 Cr - спонтанный выход 51 Cr/максим, выход 51 Cr - спонтанный выход 41 Cr × 100.
Спонтанный выход хрома измеряется на мишенях, инкубированных 4 ч (37°С) без клеток-киллеров; максимальный выход хрома - на мишенях, полностью разрушенных замораживанием-оттаиванием; все пробы осуществляются в триплетах.
Микровариант CML в планшетах [по Mawas С., 1976]:
Фаза получения киллеров осуществляется как MLC в круглодонных планшетах, но смешивают в равных количествах R- и S-клетки по 2x10 5 па каждую лунку и инкубируют при 37°С;
Через 5 сут клетки собирают пастеровской пипеткой в пробирку, подсчитывают с трипаном голубым число живых и доводят концентрацию до 10x10 6 в 1 мл;
Клетки-мишени в течение 3 дней культивируют с ФГА;
В день постановки реакции клетки-мишени отмывают (300 g) и ресуспендируют в культуральной среде, распределяя по 1 мл в пробирки и доводя до 1x10 6 в 1 мл;
Добавляют в каждую пробирку с клетками-мишенями по 200 μCi 51 Cr(7,4x10 6 БК) и инкубируют 1 ч при 37°С; отмывают клетки 3 раза; осадок ресуспендируют и доводят до концентрации 1x10 в 1 мл (живых);
Тест реализуется в круглодонных микропланшетах; для этого распределяют в каждую лунку 0,7 - 1x10 6 клеток-киллеров (0,1 мл) и 1x10 4 клеток-мишеней (0,1 мл); общий объем суспензии в каждой лунке 0,2 мл, добавляют в каждую лунку по 0,05 мл среды и инкубируют (37°С) 4 ч;
Планшеты центрифугируют при 800 g на центрифуге Beckman в течение 10 мин; супернатант из каждой лунки переносят в пробирки и подсчитывают на γ-счетчике;
Фазу получения киллеров (MLC) проводят на среде RPMJ-1640 с добавлением 20% человеческой плазмы; для фазы киллинга употребляют среду MEM с добавлением 20% человеческой плазмы, предварительно прогретой.
Прямая CML (D-CML). Прямая CML является техникой, созданной специально для клинических целей, нашедшей использование при иммунологическом мониторинге. Схема этой реакции изображена на рис. 13.
Основное отличие от традиционной CML состоит в том, что стадия образования киллеров (фаза сенсибилизации) протекает не in vitro, a in vivo, т. е. в организме человека, сенсибилизированного пересадкой аллогенного органа или ткани. Вследствие воздействия аллогенной ткани лимфоциты реципиента сенсибилизированы к тканевым антигенам донора и не нуждаются в специальной обработке in vitro, продолжительность теста значительно сокращается во времени, так как предварительно следует подготовить только мишени.
В качестве мишеней используют лимфоциты, полученные из периферической крови или, чаще, из селезенки донора (см. 2.1.2) и замороженные любым из описанных выше способов (см. 2.1.3).
Этот тип клеточных реакций сходен по механизмам действия с описанной выше CML. Принцип реакции изображен на рис. 14. Компонентами реакции являются клетки-мишени (донорские клетки или аллогенные лимфоциты), сыворотка (аллогенная или реципиента), предположительно содержащая антитела, направленные к детерминантам клеток-мишеней, и клетки-эффекторы (лимфоциты реципиента или аллогенные лимфоциты).
Клетками-эффекторами в данном типе взаимодействия служат так называемые К-клетки, находящиеся в периферической крови. В отличие от клеток-киллеров в CML они осуществляют цитотоксический эффект без предварительной сенсибилизации, однако проявление цитотоксического действия К-клеток возможно только через посредство антител, направленных к детерминантам клеток-мишеней . Специфический лизис измеряется по высвобождению 51 Cr, если исследуемая сыворотка содержит антитела к детерминантам мишеней.
Детерминантами-мишенями в ADCC могут быть практически специфичности всех HLA-локусов, включая HLA-D, HLA-DR, а также детерминанты, лежащие вне HLA-системы .
Наибольшее распространение эта сложная реакция получила в иммунологическом мониторинге для выявления В-клеточных антител. В связи с этим было предложено несколько модификаций, предусматривающих обогащение суспензии клеток-мишеней В-лимфоцитами, адсорбцию сывороток на тромбоцитах и т. д.
Помимо всего, учитывается ряд других особенностей реагирования в данной системе. Исследуемая сыворотка должна быть декомплементирована, так как в противном случае реакция может пойти по типу антитело-опосредованной комплементзависимой цитотоксичности. Предполагается также, что клетки-эффекторы могут вызвать определенную деструкцию мишеней по типу CML.
В конечном итоге весь набор проб в тесте антителозависимок клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности следующий:
Мишени + эффекторы + испытуемая сыворотка (опытная проба);
Мишени (контрольная проба, т. е. спонтанное высвобождение 51 Cr);
Мишени + эффекторы (контрольная проба на активность эффекторов);
Мишени + испытуемая сыворотка (сывороточный контроль).
Лимфоциты выделяют обычным образом и ресуспендируют в RPMI-1640 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки; обрабатывают суспензию карбонильным железом для удаления моноцитов; добавляют аммония хлорид или H 2 O для лизиса оставшихся эритроцитов;
В суспензию клеток-мишеней добавляют 51 Cr в форме р-ра Na 2 CrO 4 100 - 200µCi мл (3,7x10 6 - 7,4x106 БК/мл) и инкубируют 40 - 60 мин;
Клетки трижды отмывают в RPMI +0,1% HSA, ресуспендируют в той же среде и доводят до 2x10 8 в 1 мл; 50 µl суспензии меченых клеток помещают в пробирку и в дальнейшем подсчитывают изотопную активность на γ-счетчике для выявления полного изотопного "усвоения"; остальное раскапывают в лунки планшета по 50 µl суспензии (1x10 5 клеток на лунку);
Суспензия клеток-эффекторов доводится до 2x10 7 кл в 1 мл и в. каждую лунку помещают 50 µl суспензии (или 100 µl), соотношение эффекторов и мишеней 10:1 (или 20:1);
Инкубация продолжается 4 ч во влажной атмосфере термостата с 5% CO 2 (длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч);
Приготовляют в пробирках несколько разведений испытуемой сыворотки (1:25; 1:100) и добавляют в лунки до 50 µl каждого разведения: и неразведенную сыворотку; окончательная постановка теста выглядит, как показано в табл. 23.
Таблица 23
Постановка ADCC. Все варианты проб, µl
* (Вместо испытуемой сыворотки закапывают пул АВ-сывороток. )
** (Вместо испытуемой сыворотки закапывают моноспецифическую HLA-сыворотку, направленную против мишеней (не эффекторов). )
Инкубация панелей продолжается 4 ч во влажной атмосфере с 4% CO 2 ; длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч;
После инкубации половину объема из каждой лунки (100 μl) осторожно отсасывают автоматической пипеткой и помещают в пробирки для подсчета импульсации 51 Cr; активность подсчитывают на γ-счетчике;
Вычисления следующие:
% высвобождения 51 Cr = 2 × А оп - фоновая активность/В - фоновая активность × 100;
% цитотоксичности = А оп - А сп /100 - А сп × 100, где А оп - % высвобождения 51 Cr в опытных пробах; А сп - % спонтанного высвобождения; В - полное усвоение изотопа.
Как положительный результат рассматривается 5% и выше цитотоксичность после 4 ч инкубации.
Статьи по теме: | |
Душевнобольное искусство
О том, что психическими расстройствами страдали Ван Гог и Камилла... Расторопша — лечебные свойства уникальной травы и продуктов из нее Расторопша семена полезные свойства и противопоказания
Довольно высокое растение, которое имеет крупные пурпурные или лиловые... Сценарий на юбилей любимой маме Угадай мелодию их кинофильмов
За плечами долгий брак,Он не шутка, не пустяк!Шестьдесят он длится лет,В... |