Вакцина против вирусной диареи крупного рогатого скота. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ)

Инструкция по применению инактивированной комбинированной вакцины Комбовак-А против
инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной,
рота-, коронавирусной болезней и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
(организация-разработчик - ООО «Ветбиохим», г. Москва)

I. Общие сведения
Торговое наименование - вакцина Комбовак-А.
Международное непатентованное наименование - вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота.

Лекарственная форма - эмульсия для инъекций.
Вакцина Комбовак-А изготовлена из культуральной жидкости, инфицированной вирусами: инфекционного ринотрахеита (шт. В-25/шт. Т), парагриипа-3 (шт. В-19/шт. ВС-05), вирусной диареи (шт. СТ-89/шт. Т-04), респираторно-синцитиальным (шт. 89/шт. ТИ), рота- (шт. К-88), корона- (шт. КВ-90) и аденовирусами (шт. «Альфа») крупного рогатого скота, инактивированной формалином с добавлением 50% масляного адъюванта.
По внешнему виду вакцина представляет собой эмульсию белого или бледно-розового цвета, при хранении которой допускается незначительное отслоение эмульсии.
Вакцина расфасована по 10 мл (5 доз) и 100 мл (50 доз) в стеклянные или полимерные флаконы соответствующей вместимости, укупоренные резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками.
Флаконы с вакциной вместимостью 10 мл упакованы в картонные (пластиковые) коробки. Коробки с вакциной и флаконы вместимостью 100 мл упакованы в ящики (или другую транспортную упаковку). В каждую коробку с вакциной вкладывают инструкцию по ее применению.
Срок годности вакцины 18 месяцев от даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования. По истечении срока годности вакцина к применению не пригодна.
Вакцину хранят и транспортируют в сухом темном месте при температуре от 2°С до 8°С. Следует хранить в местах, недоступных для детей.
Флаконы с вакциной, подвергшиеся замораживанию, без этикеток, с нарушенной укупоркой и целостностью, измененным цветом, содержащие посторонние примеси, а также вакцину, не использованную в день вскрытия флакона, выбраковывают и обезвреживают путем кипячения в течение 15 мин с последующей утилизацией.
Утилизация обеззараженного препарата не требует соблюдения специальных мер предосторожности.

II. Биологические свойства
Вакцина Комбовак-А вызывает формирование иммунного ответа у крупного рогатого скота к инфекциям, обусловленным вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальным вирусом, ротавирусом, коронавирусом и аденовирусами КРС через 14 суток после двукратного применения, продолжительностью 8 месяцев у взрослых животных и 6 месяцев у молодняка в возрасте до 1 года.

Иммунитет от коров, вакцинированных в последний период стельности, передается потомству с молозивом. Колостральный иммунитет у новорожденных телят наступает после своевременной выпойки молозива (не позднее 2 ч после рождения).
Вакцина безвредна, лечебными свойствами не обладает.

III. Порядок применения
Вакцина Комбовак-А предназначена для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, корона- и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в неблагополучных и угрожаемых по данным болезням хозяйствам.

Запрещено прививать клинически больных и/или ослабленных животных.

Вакцину вводят внутримышечно взрослым животным в дозе 3 мл, телятам до 1 года - в дозе 2 мл с соблюдением общепринятых правил асептики. Для инъекции используют только стерильные материалы и инструменты. Для каждого животного используют отдельную иглу или шприц.
Перед применением в холодное время года вакцину подогревают в водяной бане до температуры 36-38°С, перед и в процессе применения флаконы с вакциной взбалтывают до образования однородной эмульсии.

Схема вакцинации №1 . Коров и телок случного возраста вакцинируют двукратно: за 4 и 1 неделю до осеменения, а затем ревакцинируют перед отелом дважды: первый раз - за 50-60 суток до отела, второй раз - через 14-21 сутки (но не позднее 30 суток до отела).

Схема вакцинации №2 . Все поголовье животных старше года прививают каждые 6 месяцев двукратно с интервалом 14-21 сутки. Не рекомендуется вакцинировать животных за 30 суток до отела и в течение 3 недель после отела.

Независимо от применяемой схемы вакцинации взрослого поголовья, телят вакцинируют в возрасте 7-10 суток и старше дважды с интервалом 20-25 суток. Ревакцинацию проводят однократно в той же дозе в возрасте 6 месяцев.

Быков-производителей вакцинируют каждые 6 месяцев двукратно с интервалом 14-21 сутки.

Симптомов проявления болезней, обусловленных вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальным, рота-, корона- и аденовирусами, или других патологических признаков при передозировке вакцины Комбовак-А не выявлено.
Особенностей поствакцинальной реакции при первичной иммунизации и ревакцинации не установлено.
Следует избегать нарушений схемы вакцинации, поскольку это может привести к снижению эффективности иммунопрофилактики болезней, обусловленных вирусами инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальным, рота-, корона- и аденовирусами. В случае пропуска очередного введения вакцины необходимо провести иммунизацию как можно скорее.
При применении вакцины в соответствии с настоящей инструкцией побочных явлений не отмечается. На месте инъекции возможно появление безболезненной, ограниченной припухлости.

Вакцину Комбовак-А не применяют в одном шприце с другими биопрепаратами и лекарственными средствами.

Убой животных на мясо разрешается не ранее 3 недель после вакцинации.
Молоко от вакцинированных животных, мясо и продукты убоя реализуют без ограничения.

IV. Меры личной профилактики
При работе с вакциной следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными средствами ветеринарного назначения.
Все лица, участвующие в проведении вакцинации должны быть одеты в спецодежду (резиновые сапоги, халат, брюки, головной убор, резиновые перчатки) и обеспечены индивидуальными средствами защиты; очками закрытого типа. В местах работы должна быть аптечка первой доврачебной помощи.
При попадании вакцины на кожу и/или слизистые оболочки их рекомендуется промыть большим количеством водопроводной воды. В случае разлива вакцины зараженный участок пола или почвы заливают 5% растворами хлорамина или едкого натрия. При случайном введении препарата человеку место введения необходимо обработать 70%-ным раствором этилового спирта, обратиться в медицинское учреждение и сообщить об этом врачу.

Организация производитель: ООО «Ветбиохим». Адрес производства: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

Новый подход к профилактике ринотрахеита.

Олейник А.В. к.б.н. технический специалист по КРС - компания Интервет

Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота (ИРТ) - вирусное заболевание, резко снижающее уровень воспроизводства. Трудно возразить этому если под снижением репродукции понимать: снижение уровня плодотворных осеменений, эмбриональную смертность, аборты, задержания последа, вагиниты, эндометриты, а также (что очень важно!) снижение сохранности молодняка и получение некондиционных телят (задохликов, санбрак, заморышей и т.д.). Даже если при идеальных 100 телятах от 100 отелившихся коров сохранность молодняка в хозяйстве составляет 80% и из них 20% "некондиции", то в результате получаем только 30 телочек пригодных к ремонту. Важно заметить, что в данном случае не представляется возможным проводить какую-либо селекционную работу - отбор по продуктивности матерей, экстерьеру и т.д. Этот пример наглядно показывает, как снижает уровень воспроизводства стада сохранность молодняка. Заболевание животных ИРТ в той или иной степени негативно сказывается на всех вышеперечисленных показателях.
Что мы знаем о болезни?

ИРТ - болезнь, вызываемая бычьим герпесвирусом первого типа (BHV-1). Заражение, в основном, происходит воздушно-капельным путем от больного животного или вирусоносителя, а также вертикальным путем при естественной случке от инфицированного быка-производителя или с зараженной спермой при искусственном осеменении. При попадании в организм вирус локализуется в эпителии дыхательных путей и репродуктивного тракта.
Клинически ИРТ проявляется ринитами, трахеитами, пневмониями, конъюнктивитами, артритами и энцефалитами (у телят), а также вульвовагинитами, абортами, эндометритами и орхитами (у взрослых животных).
Смертность от ИРТ, как правило, не превышает 20%, но при осложнении вторичной микрофлорой (сальмонеллами, пастереллами и др.) этот показатель резко возрастает.
Весь экономический ущерб от ИРТ достаточно трудно посчитать, так как снижение уровня репродукции в подавляющем большинстве случаев имеет полиэтиологичную структуру, с множеством факторов влияющих и на сохранность молодняка, и на плодовитость коров. Очевидно только одно - не решив проблему с ИРТ в хозяйстве, нет смысла рассчитывать на получение удовлетворительных результатов с воспроизводством стада.

Какие существуют способы профилактики в настоящее время?

Способ №1 - самый простой и имеющий абсолютную (!) эффективность. Смысл заключается в том, чтобы не занести вирус в хозяйство. Собственно говоря - это и весь способ! Предвижу скепсис многих читателей. Однако, большинство ветеринарных специалистов не знает как гарантированно избежать заноса инфекции. Итак, по порядку.

а) при покупке скота необходимо исследовать сыворотки крови на наличие антител к гликопротеинам gE+ и gE− вируса BHV-1 . Важно, чтобы пробы были отобраны в хозяйстве-продавце в присутствии специалистов из хозяйства-покупателя. Далее сыворотки направляются в лабораторию, которая работает с тест-системами IDEXX. Отрицательные результаты исследования на gE+ и gE− свидетельствуют об отсутствии вирусоносительства и каких-либо вакцинаций против ИРТ у покупаемых животных. Положительные результаты на gE− и отрицательные на gE+ свидетельствуют об отсутствии вирусоносительства у животных и о вакцинации их маркированной вакциной. Положительные результаты на gE− и gE+ свидетельствуют о вирусоносительстве животных, которых прививали маркированной вакциной. Положительные результаты на gE+ и отрицательные на gE− свидетельствуют о том, что животные являются носителями инфекции и (или) были привиты обычной вакциной против ИРТ.
Вопрос: какой скот можно покупать, а какой нет?
Ответ: можно покупать скот только с отрицательными результатами к гликопротеину gE+ вируса BHV-1, т.е. первый и второй варианты результатов.
Следует разъяснить ситуацию по животным вакцинированных немаркированными вакцинами. Все российские вакцины, а также бóльшая половина импортных содержат немаркированные (неотличимые от полевого вируса) вакцинные штаммы BHV-1. В результате прививки такими живыми или инактивированными препаратами в крови образуются антитела абсолютно идентичные антителам полевого вируса. Поэтому нет никакой гарантии отсутствия вирусоносительства у животных привитых немаркироваными вакцинами, как, впрочем, нет гарантии и присутствия полевого вируса в организме таких телят и коров.
б) второе, что следует делать, чтобы избежать инфицирования стада - это исключить контакт с "чужим" скотом при выпасе.
в) не допускать покупки кормов (сена, сенажа, силоса) в хозяйствах с неизвестным эпизоотическим статусом по ИРТ.

Таким образом, не используя вакцинации против ИРТ, можно гарантированно (!) иметь благополучное стадо по инфекционному ринотрахеиту КРС.
В том случае, когда свободный от вируса скот находится в непосредственной близости с неблагополучным хозяйством, следует прививать животных живыми или инактивированными маркированными (gE−) вакцинами. Какой прививать, живой или инактивированной маркированной вакциной - это вопрос противопоказаний и безопасности живой вакцины, а также степени угрозы заноса инфекции из вне.

Способ № 2 , а также все остальные способы касаются хозяйств фактически (!) неблагополучных по ИРТ.
В этом способе вообще не участвуют средства специфической профилактики.

В чем же суть метода? Речь идет о барьерном способе сдерживания инфекции (не только ИРТ).

а) система пусто-занято.
б) строго соблюдать нормы содержания газов, пыли, бактерий в воздухе
г) систематические дезинфекции с обязательным бактериологическим контролем качества до точного подбора вида дезсредства, режима и концентрации.
Смысл систематических дезинфекций заключается в одном простом правиле - при любом движении поголовья (внутри хозяйства, отделения, телятника) животные должны перемещаться из своих клеток (боксов, загонов) в чистые и продезинфицированные клетки (боксы, загоны). И это должно быть "железным" правилом, ни при каких обстоятельствах не нарушаемым.
в) в хозяйстве организовано родильное отделение с боксами и изоляторы для больных животных всех возрастов.
После отела теленок отнимается немедленно в отдельную клетку, плацента уничтожается, бокс после каждого отела дезинфицируется.
Любое заболевшее животное с малейшими подозрениями на инфекцию (повышенная температура, кашель, диарея и т.п.) немедленно отправляется в изолятор для лечения. Идея проста - чем меньше времени больное животное контактировало со здоровыми, тем меньше вероятность перезаражения всей группы. Следует знать, что при нормальных условиях содержания и кормления, для заражения здорового теленка требуются миллионы и миллиарды (!) живых клеток бактерий и вирионов вируса. Если инфекционного агента будет недостаточно для заражения, то животное не заболеет! На этом и строится вся схема №2.

Положительные стороны схемы №2 .
Одновременная профилактика существующих инфекций у молодняка.
Дезинфекции - это недорогой метод профилактики.

Недостатки схемы №2.
С помощью барьерного метода можно сдерживать, но не искоренить инфекцию.
Требуются дополнительные помещения
Необходим персонал, отдельно(!) занимающийся только вопросами дезинфекции, изоляции и т.д.

Способ №3 - специфическая профилактика ИРТ.
Проще говоря, речь пойдет о вакцинациях, типах биопрепаратов, схемах применениях, методах введения и образующемся иммунитете.

Вакцины против ИРТ бывают:
живые и инактивированные
маркированные и без маркера
моновакцины и ассоциированные

Преимущества живых вакцин

Индукция напряженного иммунитета в сжатые сроки. Формирование преимущественно клеточного иммунитета. Возможность интраназального использования и формирования местного иммунитета в раннем возрасте. В пределах одного производителя, доза живой вакцины стоит дешевле инактивированной.

Недостатки живых вакцин

Для некоторых живых вакцин против ИРТ вопрос безопасности остается открытым. При внутримышечном введении телятам с высоким титром колостральных антител происходит нейтрализация вакцинного вируса. Жесткие условия хранения и транспортировки.

Преимущество инактивированных вакцин

Безопасность. Отсутствие какого-либо живого вируса BHV-1 в хозяйстве.

Недостатки инактивированных вакцин

Индукция преимущественно гуморального иммунитета, но не клеточного или местного. Невозможность создать активный иммунитет в раннем возрасте (менее 30 дн). Возможность проявления осложнений на месте введения за счет пролонгирующих адъювантов.

Преимущества маркированных вакцин
Возможность отличить вирус вакцины от эпизоотического BHV-1. Возможность отличить антитела к вакцине от таковых к полевой инфекции. Проведение мониторинга эпизоотического состояния по ИРТ и динамики вытеснения полевого вируса.

Преимущества вакцин без маркера

Доза вакцины без маркера стоит дешевле маркерной.

Недостатки вакцин без маркера

Наличие антител к вакцине "имитирует" контакт с полевым возбудителем или вирусоносительство. Невозможность достоверно определить эпизоотический статус хозяйства и контролировать иммунный фон животных.

В отношении моно- или ассоциированных вакцин нет как таковых преимуществ или недостатков. Если хозяйство неблагополучно только по ИРТ, то нет смысла дополнительно оплачивать "ненужные" валентности. И, наоборот, при наличии нескольких возбудителей в стаде профилактика ассоциированной вакциной дешевле. При этом удобнее выстраивать схемы иммунизации, а также снижаются затраты времени и стрессовые нагрузки на животных.

Осталось ответить на последний вопрос.
Что нового в профилактике ИРТ сегодня?

На российском рынке впервые появилась живая МАРКИРОВАННАЯ вакцина - Бовилис IBR marker производства компании Интервет (Нидерланды).
Вакцина обладает рядом неоспоримых преимуществ. Высочайший уровень безопасности - возможно применение на любом (!) сроке стельности. Индукция напряженного иммунитета через 96 ч при интраназальном и через 7 дней при внутримышечном введении. Однократное введение формирует иммунитет на срок не менее 6 месяцев. Возможность надежно защитить теленка с 14 дневного возраста вне зависимости от уровня колостральных антител в крови. Маркер вакцины позволяет отслеживать динамику элиминации полевого вируса, а также позволяет достоверно судить об эпизоотическом статусе хозяйства. Специальный растворитель гарантирует стабильнсть препарата, а спрей-насадка - качественную интраназальную вакцинацию.
Программа вакцинации с использованием Бовилис IBR marker:

Первое применение в хозяйстве:

Одномоментная вакцинация всего поголовья старше 3 месяцев однократно внутримышечно или интраназально в дозе 2 мл (или по 1 мл в каждую ноздрю). Вакцинация телят возрастом от 14 дней до 3 месяцев строго интраназально по 1 мл в каждую ноздрю с повторным введением через 3,5 - 4 месяца.

Вакцинация телят:

Всех телят прививают в возрасте 2 недель строго интраназально, вакцинацию повторяют в возрасте 4 месяцев внутримышечно или интраназально.

Вакцинация коров и быков-производителей.

Ревакцинацию здоровых животных, вне зависимости от физиологического состояния, проводят через каждые 6 месяцев.
Программа вакцинации гарантирует полную защиту животных от инфекционного ринотрахеита КРС.

При применении вакцины Бовилис IBR marker рекомендуется каждые 6 мес. исследовать сыворотки крови от разных возрастных групп животных с целью мониторинга и прогнозирования инфекции. При полном вытеснении эпизоотического вируса допускается переход на вакцинацию маркированной инактивированной вакциной Bovilis IBR Мarker inac без снижения степени защиты хозяйства.

Владимир Максимович, Павел Красочко, Ярослав Яромчик, Вероника Красочко

24.02.2016 Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота — хорошо изученная и широко распространенная болезнь в странах с развитым животноводством, в том числе и в Беларуси. Практически любое животноводческое предприятие, где не занимаются специфической профилактикой, сталкивается с тем или иным проявлением болезни как у молодняка, так и у взрослых животных. Проведенные исследования на основании экспериментальных данных помогут ветеринарному врачу определить стратегию выбора подходящей схемы и вакцины против инфекционного ринотрахеита КРС в условиях конкретного хозяйства и в определенной эпизоотической обстановке.

В патологии крупного рогатого скота наибольшее распространение получили респираторная, генитальная и абортивная формы, которые наносят значительный экономический ущерб животноводству.

Следует отметить трудно диагностируемую форму инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС) — латентную. Латентное течение можно определить как замаскированную персистенцию вируса в организме хозяина. Переболевшие животные могут пожизненно оставаться скрытыми вирусоносителями. Латентное носительство вируса находится под постоянным контролем со стороны макроорганизма. При понижении резистентности организма происходит реактивация вируса из латентного состояния и его выделение во внешнюю среду. Реактивацию латентного вируса могут вызвать: нарушения условий содержания и кормления, стрессы, транспортировка, отелы, перегруппировки, вакцинации, инфицирование вирусами парагриппа-3, вирусной диареи и другие факторы.

Внедрение в организм хозяина вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота запускает каскад реакций с участием всех звеньев иммунной защиты. Антитела имеют определенное значение в развитии иммунитета при вирусных болезнях, при которых уровень циркулирующих в крови антител является показателем защиты. Функция антител состоит в защите от вирусемии и развития тяжелой клинической болезни. Гуморальный иммунный ответ включает выработку специфических антител, способных нейтрализовать вирус и участвовать в антивирусной антителозависимой клеточной цитотоксичности, которая усиливается действием комплемента.

Материнские антитела выявляются в течение 123 первых дней жизни, а у слабых телят — до двух месяцев. Новорожденные телята защищены от заражения вирусом после получения молозива от иммунизированных матерей. Однако материнские антитела не полностью защищают теленка, если у него устанавливается латентная инфекция в ранний период жизни. При вторичном заражении или рецидиве антитела играют главную роль в воздействии на вирулентность вируса и его распространение в организме животного.

Когда вакцина не дает желаемого эффекта

Для успешной борьбы с инфекционным ринотрахеитом крупного рогатого скота применяют своевременную диагностику болезни и средства специфической профилактики и терапии. Наряду с классическими живыми и инактивированными получены вакцины последних поколений — рекомбинантные и маркерные. Практическому врачу бывает сложно разобраться в многообразии биопрепаратов и определить подходящую вакцину и схему вакцинаций для конкретного хозяйства в создавшейся эпизоотической обстановке.

При проведении диагностических исследований у крупного рогатого скота практически болезнь не диагностируется, т. к. все животные или переболели, или были вакцинированы. В этой связи на ряде ферм или комплексов у животных уровень антител бывает очень высокий: или свыше 1:128-1:256, или более низкий — 1:8-1:32. Это позволяет заключить, что использование вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота не всегда дает желаемый эффект.

Учитывая это, мы провели сравнительное исследование иммунного ответа у животных при различном состоянии поствакцинального и постинфекционного иммунитета в отношении вируса инфекционного ринотрахеита. Изучена антигенная активность разных вариантов вакцин против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Материалы и методы

Работа выполнялась в условиях Научно-исследовательского института прикладной ветеринарной медицины и биотехнологии Витебской государственной академии ветеринарной медицины, а также животноводческих хозяйств Витебского и Минского районов.

На первом этапе исследований для изучения поствакцинального гуморального иммунного ответа у КРС к вирусу инфекционного ринотрахеита проводили отбор крови и получали сыворотку у сухостойных и дойных коров в хозяйствах, использующих разные варианты вакцин против инфекционного ринотрахеита. Выбор вакцин и сроки вакцинаций проводили и устанавливали специалисты хозяйств по производственным схемам обработок и вакцинаций сухостойных коров, утвержденным главными врачами районов и сельскохозяйственных организаций. Также для определения постинфекционного иммунного статуса отбирали пробы крови у сухостойных и дойных коров в хозяйствах, не проводящих вакцинацию.

Для выявления специфических антител использовали реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА). РНГА ставили путем разведения исследуемых сывороток крови в растворителе в 96-луночных полистироловых планшетах с U-образными лунками в объеме 0,025 мл в разведениях от 1:2 до 1:256.

На втором этапе исследований для изучения гуморального иммунного ответа крупного рогатого скота на введение разных вариантов вакцин против ИРТ КРС проводили вакцинацию стельных и дойных коров живыми и инактивированными вакцинами, отбирали пробы крови и получали сыворотку.

Опыты по изучению гуморального иммунного ответа на введение разных типов вакцин на втором этапе исследований проводили по представленной схеме.

• Группа № 1. Вирус-вакцина живая культуральная против ИРТ КРС. Доза - 2 см3, д
• Группа № 2. Вирус-вакцина трехвалентная живая культуральная против ИРТ КРС, ВД и ПГ3 — «Тривак». Доза - 3 см3, д вукратно с интервалом 21 день;
• Группа № 3. Вирус-вакцина поливалентная инактивированная культуральная против ИРТ КРС, ВД, рота- и коронавирусной инфекции — «Тетравак». Доза - 5 см3, д вукратно с интервалом 21 день;
• Группа № 4. Вакцина живая Bovishield Gold. Доза - 2 см3, д вукратно с интервалом 21 день;
• Группа № 5. Вакцина инактивированная эмульгированная против ИРТ КРС. Доза - 3 см3, д вукратно с интервалом 21 день;
• Контрольная группа. Физиологический раствор. Доза - 3 см3, двукратно с интервалом 21 день.

При постановке опыта всего было сформировано пять групп коров по 5-10 голов в каждой группе из клинически здоровых животных. Критерием отбора служил обязательный низкий фоновый уровень специфических антител, а также как минимум вторая лактация у коров. Все животные, за исключением коров контрольной группы, подвергались двукратной вакцинации разными вариантами вакцин с интервалом 21 день, при этом стельных коров не вакцинировали живыми вакцинами во избежание возможных абортов. Отбор крови проводили в первый день опыта, на 10-й, 21-й (день ревакцинации), на 35-й и 60-й день. Все примененные в опыте вакцины зарегистрированы в Республике Беларусь.

В ходе опыта была сформирована дополнительная группа животных, имеющих высокий титр специфических антител против ИРТ КРС. Коровам данной группы вводили вакцину инактивированную культуральную против ИРТ КРС, отбор проб проводили в сроки, описанные в вышеуказанном опыте.

Для определения уровня специфических антител в сыворотках крови использовали диагностический иммуноферментный анализ (ИФА) — набор IDEXX IBR X3. Постановку реакции проводили в соответствии с инструкцией по применению. На предыдущих этапах лабораторных исследований сывороток крови, а также предварительных исследований по выбору метода определения качества гуморального иммунного ответа было установлено, что антигенная емкость ИФА-панели недостаточна для достоверной оценки высокого содержания антител даже у непрямого варианта ИФА. Поэтому сыворотки от иммунизированных животных разводили 1:500 для более достоверной разницы между высокими значениями количества антител и использовали в реакции, за исключением сывороток от животных контрольной группы.

Результаты исследований

При оценке полученных результатов серологических исследований на первом этапе установлено, что в хозяйствах, применяющих как живые, так и инактивированные вакцины, титры специфических антител находились на уровне значения от 6,7 до 7,2 log2, в то время как у невакцинированных животных титр антител определяли в значении от 4,9 до 5,3 log2.

Результаты серологических исследований при проведении второго этапа исследований приведены на рис. 1 и 2.

Использованные в опыте для вакцинации коммерческие вакцины показали хорошую иммуногенную активность. Отмечается более высокая иммуногенность у инактивированных вакцин при двукратном их применении.

Установлена также более высокая активность живых вакцин при однократной вакцинации, т. к. применение живых вакцин для профилактики ИРТ КРС у животных создает высокий уровень титра антител к сроку следующей вакцинации.

В случае, когда фоновый уровень антител высокий, что связано с переболеванием животных и циркуляцией эпизоотического штамма вируса инфекционного ринотрахеита, эффективность проводимой вакцинации практически невозможно определить серологически. У животных из группы, сформированной из коров с высоким фоновым уровнем антител, после иммунизации инактивированной вакциной не произошло существенного прироста уровня антител, т. к. он и до вакцинации был достаточно высоким. Поэтому судить об эффективности вакцинации инактивированными вакцинами в таких условиях можно только по признакам снижения заболеваемости и сохранности молодняка. Ввиду циркуляции высокопатогенных штаммов вируса ИРТ КРС в хозяйствах, не вакцинирующих животных против этой болезни, логичным приемом при профилактике будет использование живых вакцин для вытеснения циркулирующих эпизоотических штаммов вируса вакцинным аттенуированным штаммом. После нормализации эпизоотической обстановки по ИРТ КРС следует переходить к использованию инактивированных вакцин как более безопасных.

Таким образом, в хозяйствах, не проводящих специфическую профилактику ринотрахеита и решивших ее проводить, первоначально следует определить серостатус своего поголовья. По результатам данного исследования нужно выбрать тип вакцины для применения. При низком фоновом уровне специфических антител следует использовать инактивированные вакцины, а при высоком — живые. При использовании живых вакцин следует контролировать показатели заболеваемости.

При сохранении заболеваемости животных с характерными клиническими признаками ИРТ КРС, показателей воспроизводства, оплодотворяемости коров и количества абортов на том же уровне или при ее повышении на фоне проводимой вакцинации следует отказаться от применения живой вакцины ввиду возможной произошедшей реверсии вируса. Также не стоит забывать, что без устранения нарушений в технологии содержания, выращивания и кормления скота профилактический эффект от вакцинации может быть значительно снижен.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит активное вещество и целевую добавку. В качестве активного вещества вакцина содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, сем. Paramyxoviridae, рода Parainfluenza, подтипа Parainfluenza virus 3, коллекция ВГНКИ «ВГНКИ-4»-ДЕП, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, сем. Herpesviridae, рода Varicellavirus, коллекция ВГНКИ «ВНИИЗЖ-ДЕП» и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, сем. Flaviviridae, рода Pestivirus, коллекция ФГУ «ВГНКИ» «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП. Штаммы взяты в соотношении 1:1:1 в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного после введения ему целевого препарата. Вакцина индуцирует у иммунизированных животных высокий уровень антител, иммунитет у привитых животных формируется через 10-15 суток после повторного введения вакцины и сохраняется не менее 6 месяцев. Также при соединении указанных антигенов наблюдается эффект синергизма, что позволяет снизить количественное содержание антигенов в препарате при сохранении напряженности и длительности иммунитета. 26 з.п. ф-лы, 9 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается получения и применения вакцины для профилактики респираторных заболеваний крупного рогатого скота (КРС) и особенно у новорожденных телят.

Заболевания органов дыхания у телят имеют широкое распространение и наносят значительный ущерб животноводству. По широте распространения, смертности, вынужденному убою и недополучению привесов они превалируют над всеми прочими заболеваниями. По данным многих исследователей до 80-100% телят в послеотъемный период подвержены респираторным заболеваниям (1, 2, 3).

Как правило, респираторные заболевания молодняка КРС протекают по типу смешанных инфекций. В патогенезе респираторной инфекции новорожденных телят основная роль принадлежит ассоциации возбудителей, таких как вирус парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи (ВД).

Известно, что вирусы ПГ-3, ИРТ и ВД КРС относятся к возбудителям, которые оказывают прямое воздействие на респираторный тракт животного. При этом они имеют общие «клетки-мишени», в которых размножаются.

Чрезвычайно широкое распространение, тенденция вызывать длительную персистенцию, относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают энзоотическое течение данных заболеваний в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания и кормления.

Смешанные вирусные инфекции или осложненные вторичной бактериальной микрофлорой особенно тяжело протекают и представляют серьезную проблему в плане их диагностики, лечения и профилактики.

Вакцинация животных против указанных инфекционных болезней имеет основное значение в системе профилактики эпизоотии.

В арсенале биологической промышленности во всем мире имеется большое количество препаратов, предназначенных для специфической профилактики вирусных и смешанных инфекционных респираторных заболеваний КРС и телят. При определенных условиях применения все вакцины эффективны, но отличаются по дозировке, видовому антигенному составу, сочетанию биотипов, методу инактивации вируса, используемому адъюванту и типу культуры клеток.

Однако применение известных в настоящее время препаратов не всегда сопровождается положительным эффектом из-за низкой иммуногенной активности и наличия антигенных и иммунобиологических отличий между вакцинными штаммами вирусов, входящих в состав вакцин, и эпизоотическими штаммами возбудителей, циркулирующих на территории России и стран СНГ.

Стратегия борьбы с перечисленными заболеваниями КРС во многих странах, в том числе и в России, основывается прежде всего на применении вакцин живых или инактивированных как в виде моно-, так и ассоциированных препаратов (1, 2, 3).

В настоящее время живые вакцины широко испытаны с хорошими результатами, однако они имеют ряд недостатков. Иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации: вакцина может вызвать повышенную реактогенность, иммуносупрессию, а иногда и гибель до 2% животных при вакцинации в зависимости от условий содержания и наличия коинфекций, проблемы воспроизводства, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. Кроме того, применение живых вакцин, содержащих неинактивированные антигены вирусов ИРТ и ВД КРС, категорически противопоказано для стельных коров и новорожденных телят из-за возможности гомологичной рекомбинации вакцинного и полевого штаммов вируса, ведущей к обострению инфекции, абортам и гибели отдельных животных.

Для специфической профилактики указанных заболеваний широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна ассоциированная вакцина против вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма VDV-Oregon-C24 V (САРМ V -293) вируса ВД-БС КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (САРМ 6233), 4804 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (4).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-РТОВ-8 INRV № 3760 вируса ИРТ КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (5).

Известна ассоциированная вакцина против ПГ-3, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма PI-3/T 1 /11 V-30 вируса ПГ-3 КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (САРМ 6233), 4808 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (6).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний телят «КОМБОВАК» сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из 6 производственных штаммов вирусов: ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (7).

Известна ассоциированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов КРС и телят сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов В-25 и ТК-А вируса ИРТ КРС, из штаммов ВД-N и ВД-R вируса ВД-БС КРС, из штаммов В-19 и ПТК-45/86 вируса ПГ-3 КРС, из штаммов К-88 и РП-82 ротавируса КРС, из штаммов КВ-90 и К-22 коронавируса КРС и из штаммов РС-89 и РС-71 возбудителя респираторно-синцитиальной инфекции КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (8).

Наиболее близким аналогом является вакцина «ТРИВАК (ВИЭВ)» для профилактики ИРТ, ПГ-3 и вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС) КРС, содержащая в качестве активного вещества смесь аттенуированных вирусов из штамма Herpes virus bovis «ТК-А(ВИЭВ)В-2» с активностью 4,5-6,5 lg ТЦД 50 /см 3 , штамма Virus diarrhea - mucosal disease bovinum «BK-1(B-1)N28» с активностью 4,0-6,0 lg ТЦД 50 /см 3 , штамма Paramyxovirus «ПТК-45/86» с активностью 5,0-7,0 lg ТЦД 50 /см 3 (9).

Общим существенным недостатком известных ассоциированных вакцин, в том числе вакцины-прототипа, предназначенных для профилактики массовых инфекционных респираторных заболеваний КРС различных половозрастных групп, является их недостаточно высокая эффективность вследствие:

1) неполноценности (неполноты) антигенного состава входящих в них ингредиентов и сложных взаимодействий антигенов, из которых они изготовлены;

2) невысокий титр инфекционной активности входящих в состав вакцин вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней;

3) вакцинные штаммы, входящие в состав препаратов, не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах;

4) низкой иммуногенной активности препаратов. Причиной указанного недостатка может быть использование для инактивации вирусов формалина, вызывающего деструктивные изменения вирусных белков.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных различных половозрастных групп по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах на территории РФ.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин эмульсионных инактивированных против инфекционных болезней КРС, сопровождающихся поражением органов дыхания, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» (авторское наименование) вируса ПГ-3 КРС, из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ИРТ КРС и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ВД КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении. Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

2. Активное вещество в виде смеси авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного при введении ему целевого препарата.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина ассоциированная против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток сирийского хомячка (ВНК-21), в эффективном количестве.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK), в эффективном количестве.

5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (Таурус-2), в эффективном количестве.

7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

8. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91), в эффективном количестве.

10. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK, в эффективном количестве.

12. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

13. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (RBT), в эффективном количестве.

14. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

15. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

16. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, в эффективном количестве.

17. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

18. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.

19. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

20. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС), в эффективном количестве.

21. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

22. Из целевых добавок масляный адъювант.

23. Масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%.

24. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.

25. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

26. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученных в перевиваемых культурах клеток млекопитающих, и целевые добавки масляный адъювант и сапонин в соотношении, мас.%:

В результате проведенных исследований авторами установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция. Авторами обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, выделен из легких 2-3-месячных телят с респираторной патологией. Штамм «ВГНКИ-4» адаптирован к культуре клеток почек сирийского хомячка ВНК-21 и к культуре клеток теленка Таурус-1.

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС депонирован 09 сентября 1999 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) под регистрационным наименованием «ВГНКИ-4» ДЕП.

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (10).

Морфологические признаки

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС относится к семейству Paramyxoviridae, роду Parainfluenza, подтипу Parainfluenza virus 3 и по своему строению является классическим парамиксовирусом. Внешне вирус почти сферический, но часто встречаются полиморфные формы. Размер сферических форм от 80 до 300 нм, но большинство вирионов в среднем от 130 до 140 нм.

Вирус ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4» имеет 7 структурных белков:

1. Фосфопротеиды (Р,. м.м. 83 кД).

2. ГА-нейраминидазный гликопротеин (HN, м.м. 69 кД).

3. Главный нуклеокапсидный протеин (NP, м.м. 66 кД).

4. Гликопротеин (F, м.м. 55 кД).

5. Матричный белок (М, м.м. 38 кД).

6. Белок L-полимераза (м.м. 180 кД).

7. Клеточный активный белок А (м.м. 43 кД).

В двухслойной содержащей липиды оболочке (толщина 10-И 5 нм) размещены 2 различные макромолекулы: гликопротеин гемагглютинин нейраминидаза (HN) и гликопротеин слияния (F). Оба выступают на 8 нм над оболочкой вириона с интервалом 7÷8 нм. Гемагглютинин осуществляет прикрепление вириона к рецепторам клетки-хозяина, содержащим нейраминовую (сиаловую) кислоту, а нейраминидаза разрушает рецепторы и тем самым помогает элюции вируса в процессе отпочковывания от клетки-хозяина. F-белок отвечает за проникновение вируса в клетку, осуществляя слияние с клеточной мембраной и неся ответственность за гемолиз, который происходит за счет точечного гидролиза молекулы неактивного предшественника F 0 . Известна зависимость между структурой гликопротеидов и патогенностью вируса. У патогенных штаммов оба поверхностных гликопротеида в клетках ВНК-21 включаются в вирионы только в расщепленной форме. У апатогенных штаммов гликопротеид F включается в вирионы в виде предшественника F 0 . Вирусы с нерасщепленными гликопротеидами обладают очень низкой биологической активностью, однако, если их обрабатывать трипсином, они проявляют полную биологическую активность. Белок F ответственен за гемолитическую активность и вирусиндуцируемый кариоцитоз. Посттрансляционное расщепление белка предшественника F 0 на F 1 и F 2 осуществляется клеточными ферментами.

Антигенные свойства

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы, человека и белой мыши. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3 КРС из штамма «ВГНКИ-4», сорбируют эритроциты морской свинки, КРС, овцы, кролика и белой мыши. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител на 8÷14 сутки после ревакцинации, антитела достигают пика к 16÷28 дню и сохраняются до одного года. Продолжительность и напряженность поствакцинального иммунитета обеспечивается преимущественно IgG и секреторными IgA, выработка которых стимулируется активным вакцинальным процессом. Привитые телята с титром гуморальных антител от 6,0 до 10,3 log 2 устойчивы к заражению вирусом ПГ-3 КРС. Полевые изоляты вируса ПГ-3 КРС имеют близкое антигенное родство с вирусом ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4».

Парамиксовирусы обычно состоят из одной молекулы однонитевой, линейной, спиральной РНК диаметром 15 нм, имеющей внутри полую сердцевину, модель которой напоминает колос. Молекулярный вес ее приблизительно 4,5×10 6 , что составляет примерно 5% веса вирусной частицы. Она содержит генетическую информацию для 6 структурных протеинов. Нуклеотидное секвенировние генома вируса ПГ-3 КРС показало, что он состоит из 15156 нуклеотидов.

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС предназначен для приготовления живых и инактивированных вакцин против ПГ-3 КРС. Вирус штамма «ВГНКИ-4» ПГ-3 КРС репродуцируется в культурах клеток ПЭК, ПТ, MDBK, Таурус-2 и ВНК-21 и накапливается в титрах от 6,5 до 8,5 lg ТЦД 50 /см 3 . Результаты адаптации вируса ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4» к культуре клеток ВНК-21 представлены в таблице 1. Штамм «ВГНКИ-4» является стабильным и безвредным.

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,197 г/см 3 , коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 42S.

Вирус ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4» быстро разрушается под действием высокой температуры. Возбудитель чувствителен к хлороформу, эфиру, формалину и детергентам.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK, ВНК-21, Таурус-2 в течение 10 серийных пассажей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Для получения антигенного материала из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуры клеток ВНК-21, или Таурус-2, или MDBK. Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ПГ-3 используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,10%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6÷7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5÷6 часов по 3÷5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3, полученного в культуре клеток ВНК-21, или Таурус-2, или MDBK с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не менее 5,0 log 2 до инактивации, в количестве не менее 10,0 мас.%.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, выделен из патологического материала телят, павших с явлениями ИРТ во время вспышки заболевания в СПК «Миневское» Нижегородской области в 1998 году. Вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС адаптирован к культурам клеток RBT, MDBK и Ch-91.

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ) под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (11).

Морфологические свойства

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, роду Varicellavirus, группе HPV-1, обладает морфологическими признаками, характерными для данного семейства.

Штамм «ВНИИЗЖ» включает линейную 2-цепочечную ДНК с молекулярной массой 92÷102 кД. Вирионы округлой формы, состоят из 4-х структурных компонентов: нуклеоида, капсида диаметром 120÷150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны (тегумента) и наружной оболочки. Нуклеоид тороидальной формы содержит ДНК и окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-5-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. Мембрана из глобулярного материала окружает капсид. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 200 кД.

Вирионы имеют сложную четырехуровневую (от центра к периферии) организацию: нуклеоид, капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. Вирусы формируют характерные внутриядерные включения. При прохождении через внутренний листок ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулум вирионы покрываются дополнительной оболочкой, содержащей гликопротеины и липиды.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС относится к группе 1 герпесвирусов КРС. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), реагируя с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РИГА в разведении 1:16-5-1:256.

Генотаксономическая характеристика

Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков вируса ИРТ штамма «ВНИИЗЖ»: VP 105, VP 90 (гемагглютинин), VP 74, VP 64, VP 54, VP 50, VP 47, VP 40 и VP 31. Гликопротеины g I, g III, g IV участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным в этом отношении является g IV. По данным реакции нейтрализации наибольшей иммуногенностью обладают VP 90 и VP 74. Белок, маркированный как VP 8 с м.м. 96 кД, является одним из главных белков герпесвируса-1 КРС. Он участвует в модуляции экспрессии генов класса А, стимулирует пролиферацию Т-клеток и образование антител у телят как после заражения, так и после иммунизации животных очищенным белком. За индукцию вируснейтрализующих антител к герпесвирусу-1 КРС ответственны 4- оболочечные гликопротеины, главными из которых являются g 70 и g 97, расположенные в шипиках вириона. В структуре g IV вируса ИРТ идентифицированы 3 нейтрализующих домена. Домен 1 содержит 2 перекрывающих эпитопа, домен 2 - один эпитоп. Домен 1 имеет отношение к проникновению вируса в клетки-мишени.

Биотехнологические характеристики

Вирус ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток MDBK, Ch-91 и RBT, вызывая цитопатическое действие (ЦПД), и в течение 48÷96 часов инкубирования накапливается в титрах от 6,0 до 8,0 lg ТЦД 50 /см 3 . Результаты адаптации вируса ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ» к культурам клеток Ch-91 и RBT представлены в таблицах 2 и 3. Штамм «ВНИИЗЖ» является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте CsCl составляет 1,27÷1,29 г/см 3 .

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС устойчив к воздействию низких температур: при минус 60÷70°С вирус выживает 7÷9 месяцев, при 56°С вирус инактивируется через 20 минут, при 37°С - через 4÷10 суток, при 22°С - через 50 суток, при 4°С активность вируса снижается через 30÷40 суток лишь на 1,0 lg. Раствор формалина 1:500 инактивирует вирус через 24 часа. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. В кислой среде вирус быстро теряет свою активность, но длительно (до 9 месяцев) сохраняется при рН 6÷9 и в условиях 4°С. Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса. Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK, Ch-91 и RBT в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойные культуры клеток MDBK, Ch-91 и RBT, выращенные в 1,5 дм 3 матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм 3 . Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ИРТ штамма «ВНИИЗЖ» используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,10%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6÷7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5÷6 часов по 3÷5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток Ch-91, или MDBK, или RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве не менее 10,0 мас.%.

Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС (США).

Производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах культивирования.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток млекопитающих, выбранной из группы, содержащей монослойную перевиваемую культуру клеток почки сайги (ПС), монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (Таурус-2) и монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (RBT), имеет стабильные биологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала для вакцины против ВД КРС эмульсионной инактивированной.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС (12).

По сравнению с исходным штаммом штамм «NADL-ВНИИЗЖ» имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от штамма «NADL» штамм «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируется в перевиваемых культурах клеток RBT, ПС и Таурус-2, обладает инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС характеризуется следующими признаками и свойствами(12).

Морфологические признаки

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ВД КРС: сферический вирион диаметром 40÷60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «NADL-ВНИИЗЖ» относится к первому генотипу.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус реагирует с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных инактивированный вирус индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител в организме морских свинок в титрах от 10,9 до 11,2 log 2 в ИФА и 7,0 log 2 в РМН, у кроликов - от 10,8 до 11,4 log 2 (ИФА) и от 6,0 до 7,1 log 2 (РМН), у телят и коров - от 10,2 до 10,7 log 2 (ИФА) и от 7,6±0,40 до 7,3±0,31 log 2 (РМН).

Генотаксономическая характеристика

Геном штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.

Выделено и охарактеризовано 10 протеинов: 4 структурных и 6 неструктурных. Одноцепочечная РНК связана с капсидным протеином р14/С, окруженным наружными гликопротеинами (др25/Е1, др53/Е2, др48/Е0), и липидной оболочкой.

Наружный гликопротеин gp53/E2 индуцирует в организме животных выработку вируснейтрализующих антител в высоких титрах. Протеин др48/Е0 способен индуцировать у инфицированных животных высокий уровень антител, но с низкой вируснейтрализирующей активностью. У инфицированных животных антитела к gp25/Е1 вырабатываются в низких титрах.

Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 149 н.о. 5"-нетранслируемой области.

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является близкородственным референтному штамму «NADL», от которого отличается на анализируемом участке одним нуклеотидом.

Такие единичные замены в структуре белка предположительно привели к существенным изменениям в антигенных свойствах вируса.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (MDBK, Таурус-2, ПТ, RBT), перевиваемой линии культуры клеток ПС, перевиваемой линии культуры клеток слизистой кишечника КРС (FBI) и внутривидовой гибридной перевиваемой линии культуры клеток почки эмбриона свиньи со спленоцидами свиньи (А4С2).

Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культурам клеток Таурус-2, RBT и ПС представлены в таблицах 4, 5, 6. Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,12÷1,13 г/см 3 , коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 138S.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС наиболее устойчив при рН 7,4. Вирус хорошо сохраняется в нативном виде при 4°С, минус 20°С и минус 40°С. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, кислому значению рН (3,0) и дезоксихалату натрия; при 37°С погибает через 5 дней.

Инактивированный вирус ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» устойчив при хранении при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированной вакцины.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток Таурус-2, RBT, ПС в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойные культуры клеток Taypyc-2, RBT и ПС выращенные в 1,5 дм 3 матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм 3 . Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ВД штамма «NADL-ВНИИЗЖ» используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6÷7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5÷6 часов по 3÷5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в культуре клеток Таурус-2, или RBT, или ПС, с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве не менее 10,0 мас.%.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его реализации и использования.

Для приготовления ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной используют производственные штаммы вирусов: штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС и штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС.

Технологический процесс состоит из следующих технологических этапов:

получения вирусных суспензий из штаммов вируса ПГ-3 КРС «ВГНКИ-4», вируса ИРТ КРС «ВНИИЗЖ» и вируса ВД КРС «NADL-ВНИИЗЖ»;

определения активности каждой вирусной суспензии;

инактивации вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма отдельно;

объединения полученных инактивированных суспензий

добавления адъюванта;

смешивания всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.

Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (Seed lot system) - это система, при которой последовательные серии производственного штамма получают из главного посевного материала (Master seed) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве из главного посевного материала готовится производственный штамм посевного материала. Производственное сырье культурального вируса производится из рабочего посевного материала (Working seed) или его следующей генерации - рабочей расплодки. При этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значений, установленных для каждого конкретного микроорганизма или биопрепарата, изготовленного на их основе.

Процесс получения системы посевных материалов каждого вируса включает несколько этапов:

Подбор кондиционных культур клеток;

Освежение главного посевного материала;

контроль стерильности и биологической активности главного посевного материала;

Расфасовка и хранение главного посевного материла;

Приготовление рабочего посевного материала;

Сбор инфекционного материала;

Контроль стерильности и биологической активности рабочего посевного материала;

расфасовка и хранение рабочего посевного материала.

Посевной материал, используемый для изготовления вакцины, получают в перевиваемых культурах клеток.

Для изготовления вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной используют культуральный вирус ПГ-3 КРС, выращенный в роллерных сосудах, культуральный вирус ИРТ КРС, выращенный в 1,5 дм 3 матрасах или в роллерных сосудах, и культуральный вирус ВД КРС, выращенный в 1,5 дм 3 матрасах или в роллерных сосудах.

В составе вакцины должны содержаться:

1. Антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21, или Таурус-2, или MDBK с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2, в количестве 10,0 мас.%.

2. Антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток RBT, или Ch-91, или MDBK с ифекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 , в количестве 10,0 мас.%.

3. Антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, или RBT или ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не ниже 6,65 Iog 2 , в количестве 10,0 мас.%.

4. Масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%.

5. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

Содержимое матрасов, роллерных сосудов сливают в отдельные емкости и охлаждают при температуре 2÷8°С, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование. Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья.

Производственная серия вируса ПГ-3 КРС должна иметь инфекционную активность не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 ; гемагглютинирующую активность в РГА не ниже 5,0 log 2 .

Производственная серия вируса ИРТ КРС должна иметь инфекционную активность не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 .

Производственная серия вируса ВД КРС должна иметь инфекционную активность не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 ; активность в ИФА не ниже 6,65 log 2 .

Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6%-ного раствора АЭЭИ, вносимого в вирусную суспензию каждого вируса до конечной концентрации 0,10÷0,15 мас.%. Инактивацию проводят при температуре 37,0°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием (каждые 5÷6 часов по 3÷5 мин).

По окончании инактивации антигенный материал каждого вируса охлаждают до температуры 2÷8°С и отбирают пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полученный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС и штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС используют для изготовления эмульсионной формы вакцины против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС.

Для этого антигенный материал тщательно эмульгируют с масляным адъювантом и сапонином в соотношении, мас.%: 10,0:10,0:10,0:69,6:0,4 соответственно.

Полученная вакцина представляет собой эмульсию белого или бело-розового цвета слегка вязкой консистенции. При хранении допускается незначительное отслоение минерального масла в верхней и уплотнение эмульсии в нижней части флакона. При тщательном взбалтывании эмульсия приобретает однородную структуру.

Вакцину контролируют на стерильность, стабильность, полноту инактивации (авирулентность), безвредность и антигенную активность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085.

Контроль вакцины на стабильность эмульсии осуществляют посредством центрифугирования при 400 g в течение 10 минут с последующей визуальной оценкой однородности эмульсии.

Полноту инактивации препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей вакцины в перевиваемой культуре клеток по отсутствию ЦПД, а также в РГА (для вируса ПГ-3).

Определение безвредности вакцины проводят на белых мышах или на естественно восприимчивых животных - телятах 2÷3-месячного возраста. Для этого препарат вводят подкожно в область спины в дозе 0,1 см 3 десяти белым мышам или внутримышечно в области средней трети шеи по 4 см 3 двум телятам (две прививные дозы).

Вакцина считается безвредной, если телята и лабораторные животные в течение 10 суток наблюдения остаются клинически здоровыми без каких-либо патологических изменений. На месте введения допускается местная тканевая реакция.

Антигенность вакцины проверяют на кроликах. В опыт берут 7 кроликов массой 2,0-2,5 кг. Вакцину вводят 5 кроликам подкожно в области спины по 2 см 3 . Перед вакцинацией и через 28 сут после двукратного введения вакцины с интервалом 20-25 сут у кроликов берут кровь, выдерживают при температуре (37±0,5)°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к вирусу ПГ-3 КРС в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), к вирусу ИРТ КРС в реакции нейтрализации (РН), или в реакции микронейтрализации (РМН), или в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и к вирусу ВД КРС в реакции ИФА или в реакции нейтрализации (РН) или в реакции микронейтрализации (РМН). У невакцинированных (контрольных) животных (2 головы) кровь отбирают и исследуют одновременно с вакцинированными животными. Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр специфических антител к вирусу ПГ-3 КРС в РТГА 1:32, к вирусу ИРТ КРС в РН 1:8, или в РМН 1:4, или в РНГА 1:16, к вирусу ВД КРС в ИФА 1:50, или в РН 1:4, или в РМН 1:2.

Из полученного антигенного материала была приготовленна серия вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, содержащей, мас.%:

Антигенную активность вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной проверяли на кроликах, которым вводили вакцину в дозе 2,0 см 2 . Животных иммунизировали двукратно с интервалом 20-25 суток. Через 28 суток после двукратного введения вакцины у животных отбирали кровь, отделяли сыворотку и исследовали на наличие антител к вирусу ИРТ в реакции РН, к вирусу ПГ-3 в реакции РТГА, к вирусу ВД в ИФА. Результаты исследований представлены в табл.7.

Из полученных результатов, приведенных в табл.7, видно, что средний уровень антител в сыворотках крови кроликов, привитых вакциной ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, к вирусу ПГ-3 КРС составлял 7,0 log 2 , к вирусу ИРТ КРС 5,7 log 2 и к вирусу ВД КРС 7,5 log 2 .

Таким образом, результаты, полученные на лабораторных животных, свидетельствуют о высокой антигенной активности вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной.

Проведены испытания антигенной активности предлагаемой вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Вакцину применяли в неблагополучных по данным инфекциям хозяйствах для профилактики ПГ-3, ИРТ и ВД КРС у молодняка КРС. Вакцинации подлежали клинически здоровые животные в возрасте 7-14 дней, то есть до перевода из профилактория в телятник. До вакцинации в хозяйстве отмечали массовые заболевания среди телят 1-3-месячного возраста со следующей клинической картиной: угнетение, ухудшение аппетита, серозные истечения из носа, кашель, пневмония, диарея. Количество молодняка КРС в хозяйстве составляло 495 голов, гибель среди заболевшего молодняка достигала 10%. В пробах патологического материала обнаружены геномы вирусов ВД, ИРТ и ПГ-3 КРС.

Были сформированы 2 группы телят. Первой группе (10 голов) вакцину вводили внутримышечно в области средней трети шеи двукратно с интервалом 20-25 суток в дозе 2 см 3 . Вторая группа (4 головы) служила контролем. За животными вели наблюдение в течение 35 дней. Сыворотку крови животных исследовали на наличие антител к вирусу ВД КРС в ИФА, к вирусу ИРТ КРС в РИГА, к вирусу ПГ-3 КРС в РТГА. Отбор проб сывороток крови проводили по следующей схеме: до вакцинации, перед ревакцинацией на 21 день и после ревакцинации на 35 день. Результаты представлены в табл.8.

Из табл.8 видно, что в опытной группе после ревакцинации на 35 день происходил значительный подъем уровня антител к вирусу ВД КРС до 10,9±0,35 log 2 , к вирусу ИРТ КРС до 8,6±0,47 log 2 и к вирусу ПГ-3 КРС до 7,8±0,41 log 2 . Таким образом, прирост титра антител к 35 дню после вакцинации к вирусу ВД КРС составил 3,0 log 2 , к вирусу ИРТ КРС - 3,6 log 2 , к вирусу ПГ-3 КРС - 3,1 log 2 . В контрольной группе животных титр антител к 21 дню после начала опыта постепенно снижался и составлял 5,6 log 2 к вирусу ВД, 3,8 log 2 к вирусу ИРТ и 3,0 log 2 к ПГ-3 КРС.

Применение вакцины позволило снизить падеж молодняка в хозяйстве с 10% до 5%. Заболевание отдельных животных протекало с менее выраженной клинической картиной.

Таким образом, вакцина ассоциированная против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионная инактивированная обладает высокой антигенной активностью, а титры антител, полученные в результате двукратной иммунизации животных, достигали достаточного уровня, чтобы защитить животное от данных инфекций.

Проведены испытания эффективности предлагаемой вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

В 19 животноводческих хозяйствах была испытана предлагаемая вакцина. В таблице 9 приведены результаты исследований сывороток крови от КРС, привитого вакциной ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной. Эти данные свидетельствуют об эффективности указанного препарата.

Таким образом, показана возможность оздоровления стада от респираторных заболеваний вирусной этиологии посредством применения ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной.

Источники информации

1. Инфекционные болезни животных: Справочник. Под ред. Д.Ф. Осидзе. - М.:Агропромиздат, 1987, 288 с.

2. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИИТИБН, 1998, 928 с.

3. Инфекционная патология животных: В 2Т./под ред. А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронина. - М.: «Академкнига»,2006. - Т. 1. - 911 с.

4. Пат. ЧССР № 249880; А61К 39/295, 39/108; 16.04.1987 г.

5. Пат. ЧССР № 250849; А61К 39/295, 39/108; 14.05.1987 г.

6. Пат. ЧССР № 250850; А61К 39/295, 39/108; 14.05.1987 г.

7. Наставление по применению вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусных болезней телят Комбовак, № 13-3-04/0703 от 20.03.2003 г., утвержденное Департаментом ветеринарии 20.03.2003 г.

8. Пат. РФ № 2261111; А61К 39/295, 27.09.2005 г.

9. Пат. РФ № 2111011; А61К 39/295, 20.05.1998 г.(прототип).

10. Пат. РФ № 2182494; А61К 39/155, 20.05.2002 г.

11. Пат. РФ № 2221040; C12N 7/00, А61К 39/265(C12N 7/00, C12R 1:93), 10.01.2004 г.

12. Пат. РФ № 2449013, C12N 7/00, А61К 39/12, 27.04.2012 г.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вакцина ассоциированная против парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота (КРС) эмульсионная инактивированная, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, сем. Paramyxoviridae, рода Parainfluenza, подтипа Parainfluenza virus 3, коллекция ВГНКИ «ВГНКИ-4»-ДЕП, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, сем. Herpesviridae, рода Varicellavirus, коллекция ВГНКИ «ВНИИЗЖ-ДЕП» и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, сем. Flaviviridae, рода Pestivirus, коллекция ФГУ «ВГНКИ» «NADL-ВНИИЗЖ»-ДЕП, в эффективном количестве.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток сирийского хомячка (ВНК-21), в эффективном количестве.

4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

5. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK), в эффективном количестве.

6. Вакцина по п.5, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

7. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (Таурус-2), в эффективном количестве.

8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД 50 /см 3 и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

9. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

10. Вакцина по п.9, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91), в эффективном количестве.

11. Вакцина по п.10, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

12. Вакцина по п.9, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK, в эффективном количестве.

13. Вакцина по п.12, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

14. Вакцина по п.9, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.

15. Вакцина по п.14, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

16. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

17. Вакцина по п.16, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, в эффективном количестве.

18. Вакцина по п.17, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

19. Вакцина по п.16, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.

20. Вакцина по п.19, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

21. Вакцина по п.16, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС), в эффективном количестве.

22. Вакцина по п.21, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД 50 /см 3 и активностью в ИФА не менее 6,65 log 2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

23. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит масляный адъювант.

24. Вакцина по п.23, отличающаяся тем, что она содержит масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%.

25. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит дополнительно адъювант сапонин.

26. Вакцина по п.25, отличающаяся тем, что она содержит сапонин в количестве 0,4 мас.%.

27. Вакцина по любому из пп.1÷26, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных и очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученных в перевиваемых культурах клеток млекопитающих, и целевые добавки масляный адъювант и сапонин в соотношении, мас.%:

ИРТ поражает преимущественно молодняк в крупных хозяйствах и характеризуется в основном острым воспалением верхних дыхательных путей и наружных половых органов. ИРТ проявляется в субклинической, легко и тяжело протекающих формах. Заболеваемость может достигать 100%, а смертность - 10%, особенно в период комплектования стад . Заболевание может распространяться при искусственном осеменении инфицированной спермой . Иногда наблюдают поражение (обычно у телят) центральной нервной системы. Штаммы, выделенные от телят и обладающие нейропатогенными свойствами, вероятно, представляют собой антигенный вариант вируса. Заболевание может протекать в виде ринотрахеита или пустулёзного вульвовагинита. Две формы течения заболевания вызываются разными подтипами (1 и 2) одного вируса и, по- видимому, связаны с различиями их органного тропизма. Может быть, поэтому обе эти формы не встречаются одновременно в одном и том же хозяйстве . Подтипы 1 и 2 герпесвируса крупного рогатого скота типа 1, вызывающие соответственно поражения респираторного тракта (инфекционный ринотрахеит) и гениталий (инфекционный вульвовагинит), не различаются по биологическим и серологическим свойствам, но их можно различить методом рестрикционного анализа генома. Циркуляция среди овец и коз вируса, близкородственного ГВ крупного рогатого скота типа 1, свидетельствует о том, что овцы и козы, вероятно, могут быть естественными хозяевами этого вируса. Во время температурных пиков животные быстро худеют, у лактирующих - резко снижается удой, у стельных коров часто наблюдают аборты. Вторичные инфекции усугубляют течение болезни. После острого периода болезни вирус длительное время сохраняется в организме без каких-либо клинических признаков.
Вирус обычно персистирует в региональных ганглиях в виде ДНК-копий. Факторами, способствующими переходу латентной инфекции в острую, могут быть стрессы различной природы, отелы, а в некоторых случаях неправильно проведенная вакцинация животных живой вакциной. Транспортировка животных после вакцинации может приводить к реактивации вакцинального вируса, по-видимому, вследствие повышения концентрации кортикостероидов в крови. Серонегативность при ИРТ не обязательно свидетельствует об отсутствии виру- соносительства.
В состоянии латенции подавляется генетическая экспрессия вируса. Развитие латенции и реактивация возбудителя регулируются иммунными и неиммунными механизмами. Активизация инфекции под действием дексаметазона происходит путем подавления иммунного механизма и прямого воздействия на ла- тентноинфицированные клетки.

Препарат способен реактивировать как «дикий», так и вакцинный штаммы. Реактивированные штаммы не отличаются от исходных. Реактивацию вируса ИРТ в эксперименте наблюдали спустя более 600 дней после инфицирования крупного рогатого скота .
Переболевание сопровождается стойким и длительным иммунитетом, который может передаваться потомству с антителами молозива. Однако даже выраженный гуморальный иммунитет не предотвращает персистенции вируса. В случае реинфекции вновь происходит размножение и выделение вируса, хотя болезнь протекает без видимых клинических признаков. При возникновении повторного заболевания трудно бывает отличить реинфекцию от реактивации персистируюшего вируса. Всех животных, имеющих антитела к ГВ типа 1 крупного рогатого скота, следует считать носителями вируса, находящегося в состоянии латенции.
Слизистые оболочки респираторного и генитального трактов больных животных продуцируют IgA и интерферон . Антитела в сочетании с комплементом ограничивают, но не исключают распространение герпесвируса в организме. Взаимодействие антител с клетками иммунной системы является более эффективным механизмом ограничения инфекции. Наиболее важными эффекторными клетками в антителозависимой цитотоксичности являются полиморфноядерные нейтрофилы, которые при наличии комплемента проявляют активность в отсутствие специфических антител. В подавлении инфекции клеточный иммунитет при ИРТ более эффективный, чем гуморальный, и в основном связан с Т-лимфо- цитами и макрофагами, хотя и те и другие могут поражаться вирусом.
В качестве средств специфической профилактики ИРТ в различных странах применяют живые и инактивированные вакцины. Однако в большинстве стран применяют в основном живые вакцины из аттенуированных штаммов вируса . Созданы живые маркированные вакцины на основе рекомбинантной ДНК, из которой удалены ген тимидинкиназы и другие гликопротеиновые «маркерные» гены. Вакцинация против ИРТ не предотвращает инфицирования, но зато снижает частоту возникновения (проявления) и тяжесть заболевания. Полевой вирус в организме таких животных размножается менее активно, и продолжительность его выделения короче .
Традиционные живые вакцины при ИРТ отличаются большим разнообразием. Например, в США применяют несколько живых вакцин. Большинство из них - штаммы вируса, аттенуированные длительным пассированием в первичных культурах или постоянных линиях клеток. При вакцинации живыми вакцинами необходимо использовать такие вакцинные штаммы, которые неспособны к персистенции, ибо не исключается возможность возникновения рекомбинантных вариантов при взаимодействии аттенуированного и вирулентного штаммов вируса. Имеются вакцины, полученные другим способом. Бельгийская вакцина представляет собой ts-мутант, который при 30°С размножается лучше, чем при 37°С, даже после реизоляции. Иными словами, вакцинный штамм обладает «маркером», отличающим его от полевого вируса. Подобный термочувствитель
ный мутант получен в Японии. Он сохранял свойства аттенуированного штамма после пяти пассажей на крупном рогатом скоте .
В качестве живой вакцины предложен дефектный по тимидинкиназе (ТК-) мутант. Интраназальное и внутримышечное введение вакцины телятам не вызывало развития у них признаков болезни, но способствовало образованию нейтрализующих антител и устойчивости к последующему интраназальному заражению вирулентным штаммом вируса, снижало его репродукцию в слизистой носа. Вакцинный (ТК-) штамм способен персистировать в организме привитых телят не менее 3 мес. и передаваться телятам при контакте без перехода в ТК+ генотип.
Персистенция и экскреция аттенуированного штамма вируса обнаружена также при применении других живых вакцин. Особенно часто и длительно вакцинный штамм вируса выделяется с семенной жидкостью привитых быков. Введение живой вакцины во время эстрального периода может сопровождаться поражением яичников , а вакцинация в ранний период стельности - к прерыванию беременности .
Считается, что интраназальная вакцинация более эффективна, чем подкожная или внутримышечная. Повторное введение вакцины усиливает иммунитет. Имеется ряд сообщений об успешном применении комбинированных вакцин против 2-4 возбудителей. В состав таких вакцин, кроме аттенуированного штамма вируса ИРТ, чаще всего входят аттенуированные штаммы вирусов парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота. Имеются данные, свидетельствующие об активизации носительства и выделении вируса ИРТ (вакцинного и полевого штаммов) у телят после заражения вирусом парагриппа-3 .
При интраназальном введении вакцинный вирус быстро проникает в клетки верхних дыхательных путей и глоточного кольца. Размножаясь в указанных клетках, вирус может выделяться во внешнюю среду в течение двух недель. После парентерального введения вакцинный вирус из секретов выделяется не всегда и с трудом.
Преимущество интраназальной вакцинации состоит в том, что при этом усиливается синтез IgA и локальное образование интерферона. Считается, что сухая вакцина для парентерального или интраназального применения должна содержать соответственно 105 и 104 ТЦД50/мл. Наряду с живыми вакцинами применяют инактивированные, обладающие рядом преимуществ, хотя их изготовление связано с дополнительными затратами. Инактивированные вакцины так же, как и живые, применяют двукратно с 2-3-недельным интервалом. Они могут существовать в виде моно- и комбинированных препаратов. Эффективность инактивированных вакцин против ИРТ зависит от ряда факторов, и прежде всего от концентрации протективных адъювантов.
Различные способы инактивации вируса оказывали неодинаковое влияние на антигенные детерминанты - мишени вируснейтрализующих антител. По степени разрушения антигенных детерминант инактиваторы располагались следующим образом: ультрафиолетовое облучение, нагревание (56°С), (3-пропиолак- тон и формальдегид. Согласно этим данным последнему должно отдаваться
предпочтение при изготовлении инактивированной вакцины . С целью повышения иммуногенности вакцины вирусные антигены концентрировали поли- этиленгликолем.
Инактивированная формолвакцина с масляным адъювантом из вируса ИРТ с исходным титром 108 ТЦД50/мл после двукратного введения в дозе 2 мл с 4-недельным интервалом индуцировала у телят выраженный иммунитет независимо от предшествующего иммунного фона. У телят, перенесших спонтанную инфекцию с низким титром сывороточных и отсутствием секреторных антител, после вакцинации формировались гуморальные (1:128 - 1:256) и секреторные (1:2-1:8) антитела. Наблюдалась корреляция между уровнем сывороточных антител и устойчивостью телят к заражению. Иммуносупрессия дексаметазоном показала, что вакцинация серонегативных телят не предупреждала от инфицирования и последующей латенции вируса.
В неблагополучном по ИРТ хозяйстве применяли вакцину с масляным адъювантом и ГОА. Сероконверсия наблюдалась уже после первого введения вакцины. Титр колостральных антител в сыворотке крови 6-8-дневных телят от привитых матерей был высоким. В стадах, где клиническая картина ИРТ была стертой, в сыворотке крови телят от привитых матерей титр антител составил 1:76 (у контрольных животных 1:13). Колостральный иммунитет длился 4-5 мес. Вакцинация телят вызывала сероконверсию лишь тогда, когда уровень материнских антител у них был очень низким .
Инактивированные вакцины против ИРТ и против ИРТ и ПГ-3 оказались эффективными при испытании в производственных условиях. Вакцинальный иммунитет у телят развивался, несмотря на высокий уровень колостральных антител . Иммуногенность субъединичной и инактивированной вакцин с масляным адъювантом оказалась сходной. Титр гуморальных антител у крупного рогатого скота после однократного и двукратного применения субъединичной вакцины был выше, чем при вакцинации инактивированной вакциной. Секреторные антитела формировались лишь после двукратной вакцинации и были равнозначными у животных, привитых обоими препаратами. Через 14 дней после второй прививки телята были устойчивы к интраназальному заражению вирулентным штаммом вируса ИРТ. Интенсивность размножения и продолжительность экскреции вирулентного штамма у животных, вакцинированных обеими вакцинами, были сходными. Иммунизированные телята выделяли меньше вируса и менее продолжительное время, чем непривитые.
Считают, что двукратное введение инактивированной вакцины сообщает привитым животным иммунитет продолжительностью 2 года . Имеется хороший опыт сочетанного применения живой и инактивированной вакцины ИРТ и ФРГ. Живую вакцину вводили двукратно с интервалом в 6 недель сразу после установления диагноза. Спустя 7 мес. двукратно с тем же интервалом вводили инактивированную вакцину. В результате такой вакцинопрофилактики новые случаи заболевания не регистрировали. Спустя четыре года после прекращения вакцинации животные оказались серонегативными, за исключением неко
торых телят, имевших материнские антитела перед вакцинацией. Авторы оценивают предложенную схему применения живой и инактивированной вакцины как эффективную для оздоровления поголовья . Комбинированная инактивированная вакцина, включающая высокоактивные антигены вирусов ИРТ, вирусной диареи и парагриппа-3, оказалась эффективным средством профилактики массовых патологических состояний, в том числе связанных с транспортировкой скота.
Испытание иммуногенности маркированной делеционной (gE") вакцины против ГВ-1 КРС на телятах показало, что внутримышечная или назальная иммунизация полностью не защищают от латентного инфицирования вирулентным штаммом гомологичности вируса . Инактивированная маркированная вакцина против ИРТ из негативного по гликопротеину Е штамма позволяла дифференцировать вакцинированных и инфицированных животных. Иммуногенность вакцины зависела от концентрации вирусного антигена .
Поскольку вирус ИРТ может приживляться и длительно персистировать в организме вакцинированных животных, трудно однозначно ответить на вопрос о значении специфической профилактики в оздоровлении хозяйств от ИРТ, или точнее: можно ли путем систематического применения вакцин освободить хозяйство от носительства полевых штаммов вируса. Однако имеется сообщение о том, что полного оздоровления можно достичь в результате систематического (четырехлетнего) применения в хозяйстве инактивированной эмульгированной вакцины.
Таким образом, существующие средства вакцинопрофилактики защищают крупный рогатый скот от инфекционного ринотрахеита, но не от заражения полевым вирусом, установления его латенции и последующей реактивации, реэкскреции. Однако живые вакцины при интраназально-внутримышечном применении обусловливают хороший локальный иммунитет и защиту животных от клинического проявления инфекции. Инактивированные высокоантигенные вакцины после повторного введения также индуцируют локальный иммунитет и предотвращают распространение вируса. Перспективным является разработка высокоэффективных рекомбинантных субъединичных вакцин, основанных главным образом на иммуногенности одного из главных гликопротеинов оболочки вириона, особенно гликопротеина Д. Этот гликопротеин может быть экспрессирован в бакуловирусной системе или включен в геном векторного вируса и использован в качестве живой вакцины.
Многие европейские страны для искоренения болезни используют интегрированную программу, включающую иммунизацию маркированными вакцинами, выявление и убой всех животных, имеющих антитела на полевой вирус.